目的 筛选在RA和OA患者差异表达的MicroRNAs(miRNAs),研究miRNAs在RA及OA炎性反应中发挥的的调控作用,并探讨其作用机制。方法 1.Real-time PCR检测RA、OA患者和健康对照外周血血浆、PBMC及关节液miR-16、miR-17、miR-30、miR-101、miR-106、miR-130、miR-132、miR-140、miR-150、miR-181、miR-200c、miR-203、miR-223、miR-485-5p的表达量。2.记录相关临床变量,计算疾病活动监测指标DAS28。ELISA检测血浆中APCC、IL-17、IL-18和MMP3的表达量,并与血浆、PBMC和关节液中的miR-485-5p的表达量进行相关性分析。同时对血浆、PBMC中miR-485-5p进行ROC曲线分析,评估血浆、PBMC中miR-485-5p对RA和OA的诊断能力。3.根据miRBase数据库miR-485-5p的成熟序列,合成miR-485-5p mimics及其inhibitors,利用Translipid将miR-485-5p mimics和miR-485-5p inhibitors分别转染巨噬细胞中,Real-Time PCR检测miR-485-5p表达水平。4.根据miRNA靶向作用预测数据库DIANA-MICROT,TargetScan,miRWalk miRanda,miRDB等对miR-485-5p进行靶基因预测。通过分析选定TLR4和IRAK4作为研究的靶基因,构建TLR4和IRAK4 3’UTR及其突变体萤火虫-海肾双荧光素酶报告基因系统,通过检测在细胞模型中过表达/抑制表达miR-485-5p后对荧光素酶活力的影响,验证miR-485-5p与TLR4和IRAK4之间的靶向关系。Western blot检测TLR4和IRAK4蛋白质表达水平。5.将miR-485-5p mimics和miR-485-5p inhibitors分别转染巨噬细胞,常规培养24h后收集细胞及细胞上清。提取细胞总RNA,Real-time PCR检测靶基因TLR4和IRAK4 mRNA的表达水平;ELISA检上清中下游致病因子IL-6、IL-17、IL-18、MMP3的表达。6.ELISA检测血浆及关节液中TLR4和IRAK4的表达水平,并与血浆、PBMC及关节液中的miR-485-5p进行相关性分析。结果 1.在RA患者,miR-16、miR-17、miR-30、miR-106、miR-130、miR-132、miR-200c、miR-223和miR-485-5p在PBMC中的浓度显著高于它们在血浆和关节液中的浓度,而miR-101、miR-140、miR-150、miR-203在血浆中的浓度则高于它们在PBMC和关节液中的浓度;miR-132、miR-181在血浆和关节液中的浓度则没有差异。在OA患者,miR-16、miR-17、miR-30、miR-106、miR-130和miR-200c在PBMC中的浓度显著高于它们在血浆和关节液中的浓度,而miR-101、miR-132、miR-140、miR-150、miR-203在血浆中的浓度则高于它们在PBMC和关节液中的浓度;miR-181和miR-223在关节液中的浓度显著高于其在血浆和PBMC中的浓度;miR-485-5p在PBMC的浓度高于其在血浆中的浓度,但其在血浆和关节液中没有差异。基于上述分析miR-101、miR-106、miR-132、miR-200c、miR-203、miR-223和miR-485-5p在RA和OA患者的血浆、PBMC及关节液中都是差异表达的,这些miRNAs的差异表达暗示其可能与疾病的发生发展有关。相关性分析显示血浆、PBMC和关节液中miRNAs具有显著的相关性(p<0.01),miR-223、miR-485-5p在血浆、PBMC和关节液是高度相关的。2.血浆样本中RA、OA患者IL-17、IL-18、MMP3的表达水平显著高于HC组;RA患者ACCP显著高于OA患者和HC组(p<0.05)。相关性分析显示:血浆、PBMC及关节液中miR-485-5p与RA患者的特异性诊断指标ACCP及疾病活动监测指标DAS28显著负相关,并与致病性因子IL-17、IL-18、MMP-3显著负相关(p<0.05)。ROC曲线分析显示,血浆、PBMC中miR-485-5p对RA和OA具有高诊断性,提示miR-485-5p可以作为RA和OA患者潜在的诊断标志。3.巨噬细胞转染miR-485-5p mimics后与对照组比较miR-485-5p表达水平升高15.2倍(p<0.01);转染miR-485-5p inhibitors后与对照组比较miR-485-5p表达水平降低76%(p<0.05)。结果表明,miR-485-5p mimics可以在巨噬细胞过表达miR-485-5p使其表达水平显著上调;miR-485-5p inhibitors可以抑制巨噬细胞miR-485-5p的表达使其表达水平显著下调。4.双荧光素酶报告系统验证miR-485-5p与TLR4和IRAK4存在靶向关系。Real-time PCR检测TLR4和IRAK4 mRNA表达结果显示:转染miR-485-5p mimics和miR-485-5p inhibitors对其mRNA表达水平没有影响。Western blot分析显示:过表达miR-485-5p后TLR4和IRAK4蛋白表达水平分别降低0.7倍和0.6倍,抑制miR-485-5p表达后TLR4和IRAK4蛋白表达水平分别增加1.8倍和1.5倍(p<0.05)。这些数据显示,miR-485-5p并不影响TLR4和IRAK4 mRNA的表达,而是通过抑制它们的翻译从而在转录后水平调控TLR4和IRAK4蛋白的表达。5.细胞模型中IL-6、IL-17、IL-18、MMP3的检测结果显示,与对照组相比,过表达miR-485-5p可显著抑制IL-6、IL-17、IL-18和MMP3的释放;而抑制miR-485-5p的表达可显著提高IL-6、IL-17、IL-18和MMP3的释放。这些数据表明,miR-485-5p通过调控TLR4和IRAK4的表达影响下游致病因子IL-6、IL-17、IL-18、MMP-3的释放,在TLR/IRAK4/NF-κB信号通路中起到负向调控作用。6.在RA和OA患者血浆及关节液中TLR4和IRAK4的表达水平均显著升高(p<0.05)。相关性分析显示,血浆、PBMC和关节液中miR-485-5p分别与血浆及关节液中TLR4和IRAK4呈负相关(p<0.05)。这些数据表明,在RA和OA患者,miR-485-5p的低表达与TLR4和IRAK4的高表达与我们通过细胞模型验证的结论是一致的。结论 1.血浆、PBMC及关节液miRNAs具有不同的表达模式,并且它们相互之间具有明显的相关性。2.血浆、PBMC及关节液miRNAs可以作为分析miRNA在RA和OA中作用的潜在资源,血浆及PBMC中miR-485-5p能够作为RA和OA诊断标志物。3.miR-485-5p通过靶向TLR4和IRAK4的3’UTR直接抑制TLR/IRAK4/NF-κB信号通路下游炎症因子IL-6、IL-17、IL-18、MMP-3的表达,介导其炎症反应,负向调节巨噬细胞的免疫应答反应,为miR-485-5p作为RA和OA患者潜在的诊断标志物和治疗靶标提供了实验依据。