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【背景】全球大约有2.9亿人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）[1],未治疗的慢乙肝患者中,5年后肝硬化累计发病率高达8%―20%,5年后肝癌发病率达2%―5%[2]。慢乙肝的“临床治愈”（有时也称“免疫学治愈”）,是指在慢乙肝患者血清中乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）阴转,伴或不伴HBsAg的血清学转换,以及HBV DNA持续低于检测下限。病毒学上的“彻底治愈”一词的定义是:全面清除乙型肝炎病毒,包含HBsAg、HBV DNA和肝细胞内的HBV ccc DNA[3]。聚乙二醇干扰素α（Pegylated interferon alfa,Peg IFN-α）使得干扰素α（Interferon alfa,IFN-α）的代谢时间大大延长,为慢乙肝患者治疗常用的药物。多个临床试验表明,Peg IFN-α可以显著提高慢乙肝患者体内HBsAg转阴的几率[4],并且可以降低肝细胞内HBV ccc DNA的水平[5],深入研究其中的机制对于慢乙肝患者的治疗新策略有重大的意义。外泌体属一类存于细胞外部小型的囊泡,已发现其在多种疾病的细胞间或者组织器官之间发挥着重要的信息交换和传递作用[6],例如,外泌体能参与到HBV相关成分的传播并影响NK细胞的功能[7],此外,外泌体能介导IFN-α的抗病毒作用[8]。肝脏Kuffer细胞即枯否细胞,是肝脏里的巨噬细胞,于脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）的刺激下可以出现炎症反应,在抗病毒感染以及肿瘤发生的免疫反应过程起重要的作用[9-11]。已有研究显示,外泌体能介导IFN-α作用后的肝脏非实质细胞（包括枯否细胞）的抗病毒效应[8]。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类单链核酸,其大小为19-25nt,能够与靶基因的UTR区结合,调节靶基因的表达[12],许多miRNA能直接或间接的结合HBV相关m RNA,从而调控它们的翻译和表达,包括HBV聚合酶m RNA和前基因组RNA（pregenomic RNA,pg RNA）,从而影响HBV基因的稳定性[13]。另外,作为外泌体内的一种“运载物”,miRNA能在细胞间运载交换,进一步“远程”调节细胞内的基因表达,这种远距离的调控甚至可以影响细胞内病毒的转录或者复制,包括HBV[7]、HCV[14]、HIV[15]、EBV[16]等病毒。虽然一些研究报道称外泌体可介导运输干扰素的抗病毒效应,但对于外泌体中的miRNA在此过程中是否会发挥效应以及涉及到的具体机制还知之甚少,因此,我们的研究目的是:揭示巨噬细胞外泌体是否具有抗HBV复制作用,以及外泌体发挥抗病毒作用的分子机制。【方法】选择对Peg IFN-α治疗疗效佳的患者血清标本,本研究中疗效佳组（也称应答组）定义为从干扰素治疗开始（即基线）到12周HBsAg定量下降大于0.5log10 IU/ml;HBsAg治疗后上升为非疗效佳组（非应答组）,抽提血清中的外泌体,使用电镜、蛋白印迹（Western Blot,WB）、颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）等手段鉴定外泌体。将上述血清外泌体加入Hep AD38细胞培养体系中,检测上清和细胞内各病毒成分的含量,包括上清HBsAg定量、乙型肝炎E抗原（hepatitis B e antigen,HBe Ag）定量、HBV DNA定量以及细胞内HBV ccc DNA的水平,以观察干扰素使用后患者不同时期血清外泌体对肝细胞内HBV复制的影响。抽提患者血清中外泌体的总RNA,通过深度测序技术检测miRNA含量,后续再通过RT-q PCR验证患者外泌体中差异表达的miRNA。体外细胞实验中,抽提并鉴定IFN-α处理后巨噬细胞系上清内的外泌体,将其作用于HBV复制细胞系,观察外泌体的抗HBV能力,RT-q PCR检测外泌体内的miRNA表达情况。通过比对患者血清外泌体以及单核细胞系THP-1来源的巨噬细胞培养基上清外泌体内干扰素作用后差异表达的miRNA,发现三种外泌体miRNA在干扰素作用后表达均明显上调。并继而单独观测此三种miRNA的抗病毒能力,并通过miRbase、RNA22数据库网站等生物信息技术手段预测分析,预测三种miRNA与HBV可能的结合位点,构建荧光素酶验证实验有关质粒以及miRNA的前体质粒,采用荧光素酶验证实验确定miRNA与预测位点相结合的准确性。【结果】研究发现,采用Peg IFN-α治疗应答佳的患者12周的血清外泌体相比基线时的血清外泌体,具有更强的抗HBV复制的能力,包括能够降低HBV复制细胞系上清中HBsAg、HBe Ag、HBV DNA定量以及细胞内部的HBV ccc DNA水平。通过患者血清外泌体miRNA深度测序和后续患者血清外泌体体外验证实验表明,使用干扰素治疗或处理后,患者血清以及THP-1来源的巨噬细胞上清外泌体内的miR-193a-5p、miR-25-5p、以及miR-574-5p的表达均有上调。结合此三种miRNA的模拟物mimic以及抑制剂inhibitor,发现部分miRNA对HBV细胞系的相关病毒学指标有抑制作用,而且部分miRNA的inhibitor能恢复IFN-α处理后THP-1细胞上清外泌体抗HBV的作用,说明miRNA参与到了巨噬细胞上清外泌体抗病毒的过程中。进一步结合生物信息学分析数据库（RNA22、miRbase数据库）发现,miR-25-5p以及miR-574-5p有潜在与HBV m RNA结合的相关位点（3087-3093以及2750-2757）。进一步构建该HBV相关位点的荧光素酶报告质粒（含有预测位点序列或者突变序列）,使用前体miRNA（precursor miRNA,pre-miRNA）质粒以及内参海肾质粒为对照,荧光素酶报告实验表明miR-574-5p能降低含HBV预测位点质粒的荧光素酶的活性,而不能降低含有HBV突变序列的荧光素酶质粒的荧光素酶活性,说明miR-574-5p能与HBV pg RNA相应位点特异性结合,从而发挥抗HBV复制作用;而采用miR-25-5p,未能发现含有HBV pg RNA相应位点的荧光素酶活性的改变,说明miR-574-5p能与HBV pg RNA相应位点（nt2750-2757）结合,该位点与HBV基因的pol m RNA重合,研究发现该miRNA也能与pol m RNA结合,促使polymerase的降解。【结论】我们的研究证实,干扰素作用后,巨噬细胞外泌体能携带miRNA（主要是miR-574-5p）,进入HBV感染的肝细胞内,与HBV pg RNA结合发挥抑制HBV转录和复制的作用。