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目的:以贝伐单抗为代表的抗血管生成药物联合以铂类为基础的化疗方案可显著延长非鳞非小细胞肺癌患者的生存期,但最终肿瘤仍会不可避免地发生耐药,侵袭、转移增加。Claudin5(CLDN5)是内皮和上皮细胞紧密连接蛋白结构中表达的一种蛋白结构,其参与了内皮细胞的增殖、渗漏和恶性肿瘤的转移。本文通过观察贝伐单抗对紧密连接蛋白(CLDN5)之作用以及紧密连接蛋白变化对肿瘤侵袭、转移的影响,探讨贝伐单抗抗血管生成治疗诱发肿瘤耐药、增加侵袭转移的可能机制。方法:选取状态良好的人脐静脉内皮细胞(HUVECs),当细胞长至70%-80%融合度时,给予不同剂量的贝伐单抗(0μg/ml,10μg/ml,100μg/ml)于恒温孵箱(37℃,5%CO2)培养24小时后,进行Western-blot、Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction(Q-PCR)和免疫荧光实验,观察不同剂量贝伐单抗对CLDN5的影响;利用免疫组化实验来验证贝伐单抗对CLDN5的影响,选取5-8周龄的免疫缺陷小鼠(BALB/c-nu小鼠),皮下种植A549细胞形成肺腺癌移植瘤模型,小鼠成瘤后给予小鼠腹腔注射贝伐单抗(浓度分别为0,5,50mg/kg),于3周后处死小鼠,取出移植瘤石蜡包埋切片行免疫组化,观察不同药物浓度贝伐单抗作用下移植瘤内血管内皮细胞CLDN5的表达情况。利用Western-blot和Q-PCR实验探索贝伐单抗影响CLDN5的可能的分子机制,分别给予PI3K,JNK和TGFβ1通路的抑制剂以及si RNA来验证贝伐单抗对CLDN5的调节是否通过PI3K,JNK及TGFβ1通路,利用免疫共沉淀实验来验证VEGFA,PI3K及JNK的关系。给予CLDN5的si RNA敲除CLDN5来观察CLDN5对血管内皮细胞生物学功能的影响;利用MTT实验检测CLDN5对HUVEC增殖能力的影响;利用Transwell以及细胞划痕实验来观察贝伐单抗以及CLDN5对血管内皮细胞迁移能力的影响;利用Transwell侵袭实验检测贝伐单抗以及CLDN5对血管内皮细胞侵袭及渗漏功能的影响,利用体内渗漏实验来验证不同剂量贝伐单抗对血管内皮细胞渗漏功能的影响,给予小鼠腹腔注射贝伐单抗14天后,用7%水合氯醛麻醉小鼠,给予EVANS BLUE尾静脉注射,10分钟后取小鼠腹部皮肤,观察小鼠血管的渗漏情况。并在小鼠视网膜微血管内皮细胞(Mouse retinal microvascular endothelial cells,MRMECs)中验证HUVEC细胞中贝伐单抗对CLDN5的影响及其分子机制。结果:1.贝伐单抗对CLDN5的影响:不同浓度(0μg/ml,10μg/ml,100μg/ml)的贝伐单抗处理HUVECs 24小时后,进行Western-blot和Q-PCR实验。Westernblot和Q-PCR分别在蛋白和RNA水平显示,与对照组相比低浓度贝伐单抗上调CLDN5的表达,高浓度贝伐单抗下调CLDN5的表达。用免疫荧光及免疫组化实验进一步验证上述结果,亦表明高剂量贝伐单抗使CLDN5下调,低浓度使其上调。MRMEC细胞系进一步验证的结果与上述结果一致。2.贝伐单抗调节CLDN5的分子机制:(1)PI3K通路:给予HUVECs细胞PI3K的抑制剂(LY294002)及si RNA处理后,结果表明与对照组相比PPI3K及CLDN5均下调,再给予贝伐单抗治疗后,P-PI3K及CLDN5均被上调。MRMEC细胞系进一步验证的结果与上述结果一致。(2)JNK通路:给予HUVECs细胞JNK的抑制剂(SP600125)及si RNA处理后,结果表明与对照组相比P-JNK及CLDN5均下调,再给予贝伐单抗治疗后,下调的P-JNK及CLDN5又均被上调。MRMEC细胞系进一步验证的结果与上述结果一致。(3)VEGF,PI3K以及与JNK之间关系的研究:免疫共沉淀实验结果表明,VEGF和PI3K以及PI3K和JNK之间存在蛋白-蛋白相互作用。给予VEGF165细胞因子刺激HUVECs细胞5分钟后,我们发现P-PI3K和CLDN5均下降。给予HUVECs细胞JNK的si RNA刺激后,我们发现P-PI3K上调,给予PI3K的si RNA刺激后,P-JNK下调。说明VEGF在PI3K的上游,PI3K在JNK的上游。(4)高剂量贝伐单抗通过上调TGFβ1下调CLDN5。给予TGFβ1抑制剂(SB431542)刺激后,我们发现低剂量贝伐单抗对TGFβ1影响不明显,而高剂量贝伐单抗使TGFβ1上调,同时SB431542使CLDN5下调,又可以被贝伐单抗逆转。(5)给予贝伐单抗及安罗替尼序贯治疗后,发现安罗替尼可以逆转高剂量贝伐单抗对CLDN5的下调,同时可以逆转贝伐单抗对TGFβ1的上调。3.不同剂量的贝伐单抗对HUVECs生物学功能的影响:(1)细胞划痕实验结果高剂量组贝伐单抗HUVECs迁移能力增强,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。(2)Transwell迁移实验结果与对照组相比,高剂量贝伐单抗组HUVECs迁移细胞数明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)Transwell侵袭实验结果与对照组相比,高剂量贝伐单抗细胞侵袭能力明显增强,低剂量贝伐单抗组HUVECs侵袭细胞数较对照组减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)渗漏实验结果与对照组相比,高剂量贝伐单抗组经单层HUVECs细胞和基质胶渗漏的A549细胞数明显增多,而低剂量组较对照组减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)体内渗漏结果实验结果表明,高剂量组小鼠血管渗漏的EVANS BLUE明显增多,而低剂量组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.CLDN5对血管内皮细胞生物学功能的影响使用CLDN5si RNA转染HUVECs细胞后,行Western-blot和Q-PCR实验。结果表明,CLDN5在蛋白和RNA水平均明显降低。敲除CLDN5后,HUVECs的增殖能力降低,迁移、渗漏能力较对照组明显增强,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:1.高剂量贝伐单抗使紧密连接蛋白CLDN5下调,低剂量使其上调。2.低剂量贝伐单抗通过下调VEGF,上调PI3K及JNK,继而上调CLDN5的表达;高剂量贝伐单抗通过上调TGFβ1下调CLDN5。3.安罗替尼可以通过调节TGFβ1逆转高剂量贝伐单抗对CLDN5的调节。4.高剂量贝伐单抗使血管内皮细胞迁移、侵袭、渗漏能力增强。5.敲除CLDN5后,血管内皮细胞增殖能力减弱,迁移、渗漏能力增强。