目的:肠病毒71型（enterovirus 71,EV71）属于小RNA病毒,是人类手足口病主要病原体之一。EV71主要感染儿童,并会造成严重的神经并发症甚至死亡。EV71感染的致病机制目前尚不十分清楚,目前也没有被临床认可的疫苗和有效的治疗手段。在这里,我们介绍了一种新型的应用生物发光成像技术检测EV71感染的方法。方法:我们构建了一种能够表达融合蛋白AmNLuc（Q/G）BCLuc的报告质粒,它由分开的荧光素酶以及EV71 3C^pro切割位点构成。当融合蛋白被3C^pro切割后会恢复荧光素酶活性。结果:报告质粒AmNLuc（Q/G）BCLuc可以被3C^pro特异性切割并回复荧光素酶活性,其荧光强度与EV71感染量成正相关,可通过荧光素酶生物发光成像的方式实时且定量的监测细胞和小鼠中的EV71感染。应用这种方法,我们评估了Raf-1抑制剂GW5074和MEK1/2抑制剂U0126对EV71感染的抑制效果。结果发现我们所应用最高浓度的GW5074可以对体外（20μM）和体内（0.2 mg/kg）EV71感染的抑制率超过50%。Western blotting结果显示GW5074的抗EV71活性可能与其阻断MAPK通路有关。GW5074可能成为有效治疗EV71感染的候选药物。应用报告质粒AmNLuc（Q/G）BCLuc所得到的生物发光成像结果与Western blotting和组织病理学检测结果相一致。结论:这种实时的生物发光检测方法可以定量的检测抗EV71制剂的效果,对于抗EV71制剂的筛选和EV71致病机制的研究有很大帮助。