论文部分内容阅读
目的通过重组可溶性小鼠肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）干预治疗免疫介导的SAA模型小鼠,观察其对SAA小鼠模型疗效;探索并建立CD8+T细胞体外刺激培养体系,分析探讨重型再生障碍性贫血（Severe aplastic anemia,SAA）中TRAIL对CD8+T细胞功能的影响及相关机制,为SAA免疫发病机理的进一步完善及开辟新的靶点治疗SAA提供基础理论。方法第一部分:建立免疫介导的SAA小鼠模型,用重组可溶性小鼠TRAIL腹腔注射干预治疗,分正常小鼠组,SAA模型组,TRAIL治疗SAA模型组,于造模第17天收获小鼠,比较观察各组小鼠右侧股骨骨髓增生程度、外周血象及骨髓细胞计数;并采用ELISA法检测各组小鼠血浆IL-2、IL-12、TNF-a、IFN-γ的表达水平。第二部分:建立免疫介导的SAA小鼠模型,取SAA小鼠的骨髓细胞,免疫磁珠分选出纯化小鼠骨髓CD8+细胞,应用抗小鼠CD3/抗小鼠CD28单抗及重组小鼠IL-2因子联合刺激体外培养CD8+细胞。分medium组,CD3/CD28刺激组,CD3/CD28+重组小鼠TRAIL干预组。采用流式细胞术（FCM）法检测SAA模型小鼠骨髓中CD8+T细胞表面功能分子CD25表达水平及CD8+T细胞的凋亡情况。第三部分:取SAA患者的骨髓细胞,免疫磁珠分选出纯化SAA患者骨髓CD8+T细胞,应用抗人CD3/抗人CD28单抗及重组人IL-2联合刺激体外培养CD8+T细胞。分medium组,CD3/CD28刺激组,CD3/CD28+重组人TRAIL干预组体外培养,FCM法检测各组培养CD8+T细胞的CD69,HLA-DR,CD25等功能活化分子表达水平,穿孔素、颗粒酶表达水平,磷酸化ZAP70分子表达水平,凋亡水平。ELISA法测定各组培养上清中IL-2、IL-12、TNF-a、IFN-γ浓度。结果第一部分:1,正常对照小鼠骨髓有核细胞增生程度90%,SAA模型小鼠骨髓有核细胞增生程度20%,TRAIL治疗组小鼠骨髓有核细胞增生程度（40%）。2,正常对照小鼠组外周血WBC,PLT,RBC分别为（4.49±0.60）×109/L、（585.4±23.8）×109/L、（9.76±0.21）×1012/L。SAA模型小鼠组分别为（0.24±0.06）×109/L、（49.4±14.34）×109/L、（4.74±0.67）×1012/L。TRAIL治疗小鼠组分别为（0.6±0.05）×109/L、（163.1±43.9）×109/L、（6.07±0.53）×1012/L。TRAIL治疗组外周血WBC,PLT,RBC数明显高于SAA模型小鼠组（P值均<0.001）。3,正常对照小鼠组、SAA模型小鼠组、TRAIL治疗组骨髓细胞计数分别为（6.185±0.3188）×107/L、（2.03±0.1317）×107/L、（2.994±0.1151）×107/L。TRAIL治疗组骨髓细胞计数明显高于SAA模型小鼠组（P<0.0001）。4,SAA模型小鼠组外周血浆IFN-γ,TNF-α,IL-2,IL-12浓度分别为（41.79±0.7982）pg/ml、（141.8±7.429）pg/ml,（25.5±0.5597）pg/ml,（90.04±2.452）pg/ml。TRAIL治疗组浓度分别为（29.52±0.7205）pg/ml、（85.93±2.781）pg/ml,（18.52±0.807）pg/ml,（77.92±1.89）pg/ml,TRAIL治疗组IFN-γ,TNF-α,IL-2,IL-12浓度明显低于SAA模型组（P均<0.01）。第二部分:1,SAA模型鼠骨髓CD8+细胞培养中CD3/CD28刺激培养组CD8+T细胞的CD25分子表达率为（18.43±1.892）%,CD3/CD28+TRAIL干预组为（6.94±0.31）%,medium组为（0.52±0.11）%。CD3/CD28刺激培养组明显高于CD3/CD28+TRAIL干预组（P<0.001）。2,CD3/CD28刺激培养组CD8+T细胞的凋亡率为（16.80±1.10）%,CD3/CD28+TRAIL干预组为（16.78±1.35）%,medium组为（0.21±0.006）%。CD3/CD28刺激培养组与CD3/CD28+TRAIL干预组比较无差异统计学意义（P=0.9817）。第三部分:1,SAA患者骨髓CD8+细胞培养中anti-CD3/CD28刺激培养组CD8+T细胞的CD69,HLA-DR,CD25分子表达率分别为（40.8±1.68）%、（71.55±1.99）%、（50.9±3.06）%。CD3/CD28+TRAIL干预组分别为（30.2±1.78）%、（59.33±2.27）%、（39.05±3.18）%。CD3/CD28刺激培养组明显高于CD3/CD28+TRAIL干预组（P均<0.01）。2,CD3/CD28刺激培养组CD8+细胞的凋亡率为（30.78±1.33）%,CD3/CD28+TRAIL干预组为（30.18±1.51）%,比较无差异统计学意义（P=0.4827）。3,CD3/CD28刺激培养组CD8+T细胞的穿孔素表达率（28.42±1.71）%,明显高于CD3/CD28+TRAIL干预组（15.53±2.29）%,（P<0.0001）。4,CD3/CD28刺激培养组CD8+T细胞的颗粒酶平均荧光强度（8465±211.6）%明显高于CD3/CD28+TRAIL干预组（7722±74.99）%,（P<0.0001）。5,CD3/CD28刺激培养组CD8+T细胞的p-ZAP70分子表达平均荧光强度（418800±16140）明显高于CD3/CD28+TRAIL干预组（302200±9796）,（P<0.0001）。6,CD3/CD28刺激组骨髓CD8+T细胞培养上清IFN-γ,TNF-α,IL-2,IL-12浓度分别为（447.7±26.61）pg/ml、（1126±40.4）pg/ml、（2434±259.5）pg/ml、（1020±54.32）pg/ml。anti-CD3/CD28+TRAIL干预组浓度分别为（281.4±21.82）pg/ml、（641.7±26.1）pg/ml、（1499±130.8）pg/ml、（768.7±28.46）pg/ml。CD3/CD28+TRAIL干预组明显低于anti-CD3/CD28刺激组（P均<0.01）。结论1,建立免疫介导SAA小鼠模型成功。与SAA模型组相比,TRAIL治疗SAA小鼠组外周血细胞及骨髓细胞数均有明显升高,TRAIL治疗SAA小鼠组血浆中IL-2、IL-12、TNF-a、IFN-γ水平较SAA模型组减低,提示重组小鼠TRAIL因子可以减轻SAA小鼠的炎症反应程度,且对再障小鼠的血象和骨髓象恢复有一定的治疗作用。2,体外扩增培养小鼠骨髓CD8+T细胞需加入anti-CD3/CD28单抗刺激。TRAIL因子可在体外下调重型再生障碍性贫血小鼠骨髓中CD8+T细胞表面CD25的表达,从而可能对CD8+T细胞功能亢进具有抑制作用,而TRAIL对于重型再生障碍性贫血小鼠骨髓中CD8+T细胞的凋亡水平并无明显影响。3,细胞体外培养实验中,重组人TRAIL因子在体外对SAA患者CD8+T细胞表面穿孔素和颗粒酶的表达水平有一定的下调作用。能一定程度上抑制CD8+细胞IL-2、IL-12、TNF-a、IFN-γ等细胞因子的分泌。对CD8+细胞的磷酸化ZAP70分子的表达水平有抑制作用,但对CD8+细胞的凋亡水平并无明显影响。4,TRAIL在SAA中可下调CD8+T淋巴细胞的ZAP-70分子磷酸化水平,抑制CD8+T淋巴细胞活化,减低其功能活化分子CD69,HLA-DR,CD25的表达水平,从而减少其分泌穿孔素,颗粒酶,IFN-γ,TNF-α,IL-2,IL-12水平。本研究揭示了重组TRAIL很可能是治疗SAA的一种富有前景的新药物,并为此新疗法提供了一定的理论基础。