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目的:糖尿病可引起痴呆及认知功能障碍,但具体机制尚不清楚。海马突触可塑性为大脑学习记忆的神经生物学基础,而长时程增强(Long-term Potentiation,LTP)为评估海马神经环路突触传递可塑性的重要指标。有研究显示,糖尿病可影响突触传递,抑制海马区LTP的产生与维持。其中,LTP诱导及形成的分子机制可简述为:谷氨酸释放,引起突触后膜N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)谷氨酸受体激活,Ca2+内流,并与钙调蛋白(CaM)形成Ca2+/CaM复合物,进一步活化钙/钙调素依赖性蛋白激酶-Ⅱ(CaMKⅡ),最终导致α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑-丙酸(AMPA)谷氨酸受体迁入突触后膜、电导增强,产生LTP。丁苯酞是一种神经保护性药物,具有改善脑部微循环、抑制炎症反应、保护线粒体等作用,目前广泛用于缺血性脑血管病的治疗,已有研究表明,其对糖尿病认知功能障碍也有明显的改善作用。故在本研究中,我们通过应用丁苯酞,观察其对2型糖尿病模型db/db小鼠学习记忆障碍及海马神经元NMDAR-CaMKⅡ-AMPAR通路的影响。方法:1动物分组16只6周龄的健康雄性db/db小鼠(体重38g~42g),随机分为:糖尿病对照组(DM组,n=8)和丁苯酞干预组(DM-NBP,n=8),8只同周龄体瘦的、非糖尿病db/m小鼠(体重17~19g)作为正常对照组(NC,n=8)。2药物干预适应性喂养1周后,DM-NBP组小鼠每天给予溶解于植物油中的丁苯酞灌胃,剂量为120mg/kg/d,NC组和DM组仅给予等量的植物油灌胃,每日1次,共持续6周。3一般情况观察观察并记录小鼠精神状态、皮毛光泽、进食水及尿量等情况,同时检测小鼠的体重及血糖变化。4行为学检测各组小鼠分别于丁苯酞干预6周后进行Morris水迷宫实验,包括定位航行实验和空间探索实验两部分,定位航行实验共历时5天用以记录逃避潜伏期,再于第6天进行空间探索试验用以记录小鼠在自由泳60s内穿越平台的次数。5电生理学检测小鼠在体海马LTP实验于水迷宫实验结束后进行,将小鼠头部固定于脑立体定位仪上,连接电极并给予适当电流刺激,记录高频刺激前后群峰电位(population spike,PS)的幅度变化。6 mRNA及蛋白观察指标电生理试验结束后将小鼠处死,并取其海马组织,行RT-PCR检测海马NMDAR2B、CaMKⅡ、AMPAR1的mRNA表达水平;应用蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测细胞NMDAR2B、CaMKⅡ、AMPAR1的蛋白表达水平。7统计学方法所有数据均使用SPSS 13.0统计软件进行统计,应用均数±标准差((?)±s)表示。逃避潜伏期所得数据应用重复测量方差分析比较。空间探索、LTP等实验记录数据的组间比较应用单因素方差分析,两两比较采用S-N-K检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1一般情况观察NC组小鼠精神状态良好、反应灵敏、毛色光亮,进食水及尿量均正常;DM组和DM-NBP组小鼠则表现为反应迟钝、少动、毛发稀疏、多尿、多饮及多食等现象。丁苯酞干预6周后,DM组和DM-NBP组小鼠血糖及体重均明显高于NC组,且差异有统计学意义(P<0.05)。但DM组与DM-NBP组的血糖及体重相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。2行为学测试结果2.1定位航行实验测试第1天,各组小鼠逃避潜伏期无明显差异(P>0.05);测试第2-5天,与NC组相比,DM组和DM-NBP组逃避潜伏期明显延长(P<0.05);而DM-NBP组较DM组逃避潜伏期缩短(P<0.05)。2.2空间探索实验三组间小鼠比较,穿越平台次数依次减少:NC组>DM-NBP组>DM组。2.3基础游泳速度水迷宫测试前,让小鼠进行60s的自由泳,结果显示DM组与DM-NBP组小鼠间基础游泳速度无统计学差异(P>0.05)。3电生理学检测结果与NC组相比,DM组和DM-NBP组PS幅值明显降低,LTP受损(P<0.05);而DM-NBP组较DM组PS幅值增加(P<0.05);各组间顺序表现为:NC组>DM-NBP组>DM组。4 RT-PCR结果4.1与NC组相比,DM组和DM-NBP组海马NMDAR2B mRNA表达量降低(P<0.05);而DM-NBP组较DM组海马NMDAR2B mRNA表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.2与NC组相比,DM组和DM-NBP组海马CaMKⅡ mRNA表达量降低(P<0.05);而DM-NBP组与DM组相比,海马CaMKⅡ mRNA表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.3与NC组相比,DM组和DM-NBP组海马AMPAR1 mRNA表达量降低(P<0.05);而DM-NBP组与DM组相比,海马AMPAR1 mRNA表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05)。5 Western blot结果5.1与NC组相比,DM组和DM-NBP组海马细胞NMDAR2B蛋白表达量降低(P<0.05);而DM-NBP组较DM组海马细胞NMDAR2B蛋白表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05)。5.2与NC组相比,DM组和DM-NBP组海马细胞CaMKⅡ蛋白表达量降低(P<0.05);而DM-NBP组与DM组相比,海马细胞CaMKⅡ蛋白表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05)。5.3与NC组相比,DM组和DM-NBP组海马细胞AMPAR1蛋白表达量降低(P<0.05);而DM-NBP组与DM组相比,海马细胞AMPAR1蛋白表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1 13周龄的糖尿病db/db小鼠海马NMDAR-CaMKⅡ-AMPAR的表达下调,LTP降低,与其学习记忆成绩下降相一致,提示NMDAR-CaMKⅡ-AMPAR的表达下调及LTP降低,可能参与了糖尿病认知障碍的发生。2丁苯酞可能通过上调糖尿病小鼠海马NMDAR-CaMKⅡ-AMPAR的表达,增强LTP,进而改善糖尿病认知功能障碍。