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目的培养原代乳小鼠心肌细胞,用经过特殊化学修饰的微小RNA-1(microRNA-1, miRNA-1)激动剂ago-miRNA-1转染细胞,以构造miRNA-1过表达细胞模型,从而模拟缺血性心律失常的病理状态。以与心律失常密切相关的KCNJ-2、GJA-1基因表达及其编码的内向整流性钾通道2.1(inwardly rectifying potassium2.1, Kir2.1)及细胞间缝隙连接蛋白43(Connexin43, Cx43)蛋白为指标,观察不同浓度的可溶性环氧化物水解酶抑制剂(soluble epoxide hydrolase inhibitor, sEHi)trans-4-[4-(3-adamantan-1-ylureido)-cyclohexyloxy]-benzoic acid (t-AUCB)对其影响。本研究探讨t-AUCB对缺血性心律失常的作用及可能机制,有利于开拓对sEHi的认识,并为临床缺血性心律失常的防治提供新思路。方法选取新生一天的昆明小鼠,断头取心脏,将心脏剪碎后用胰酶反复消化,收集细胞悬液,再离心收集细胞,加入MEM5完全细胞培养基,放入培养箱培养。采用差速贴壁及化学法两种方法抑制成纤维细胞生长,以纯化心肌细胞。24小时后显微镜下观察细胞形态及搏动的变化情况,并针对心肌细胞胞浆中特异的横纹肌肌动蛋白进行免疫荧光检测,鉴定原代乳小鼠心肌细胞的纯度。构建miRNA-1激动剂ago-miRNA-1,待心肌细胞培养24小时后,选用200nM浓度转染心肌细胞,以构造miRNA-1过表达细胞模型,以错序的ago-miRNA-1-NC作为阴性对照,实时荧光定量多聚酶链式反应(Realtime-PCR)验证转染成功。将培养的心肌细胞分为以下几组：(1)空白对照组：心肌细胞不做任何转染及药物处理。(2) ago-miRNA-1转染组：心肌细胞培养24小时后,200nM ago-miRNA-1转染48小时。(3)ago-miRNA-1-NC转染阴性对照组：心肌细胞培养24小时后,200nM ago-miRNA-1-NC转染48小时。(4)ago-miRNA-1转染+t-AUCB干预组(浓度梯度干预)：心肌细胞培养24小时后,转染200nM ago-miRNA-148小时,再加入不同浓度的t-AUCB干预细胞24小时。通过Realtime-PCR测定不同分组心肌细胞的miRNA-1及KCNJ-2、GJA-1的mRNA表达,免疫印迹法(Western Blot)测定心肌细胞的Kir2.1及Cx43蛋白的表达。结果1.培养的原代乳小鼠心肌细胞贴壁,形态多样,呈簇生长,有明显搏动,纯度达到95%左右。2.200nM ago-miRNA-1为最适宜转染乳鼠心肌细胞浓度,且ago-miRNA-1组miRNA-1相对表达量为38.19±3.92,与空白对照组(control)相比,有统计学差异(P<0.05)。用ago-miRNA-1结构相似的ago-miRNA-1-NC (200nM)作为阴性对照,转染的心肌细胞miRNA-1相对表达量为1.80±0.37,与空白对照组(control)相比,无统计学差异(P>0.05),表明miRNA-1过表达细胞模型构建成功。3.与空白对照组(control)相比,ago-miRNA-1组miRNA-1相对表达明显升高,有统计学差异(P<0.05); ago-miRNA-1-NC组miRNA-1表达与空白对照组相比,无明显差异(P>0.05)。药物干预组运用t-AUCB2,5,10,20μM后,结果显示t-AUCB可呈浓度依赖性降低已构建的miRNA-1过表达的乳小鼠心肌细胞中miRNA-1的表达。乳小鼠心肌细胞的miRNA-1相对表达量分别为0.62±0.10,0.46±0.05,0.36±0.03,0.28±0.04,与ago-miRNA-1组相比,均有统计学差异(all P<0.05)。4.与空白对照组(control)相比,ago-miRNA-1组GJA-1及KCNJ-2mRNA相对表达量明显下降,且有统计学差异(P<0.05)；ago-miRNA-1-NC组GJA-1、KCNJ-2mRNA表达与空白对照组相比,无明显差异(P>0.05)。药物干预组使用t-AUCB2,5,10,20pM,结果显示t-AUCB可呈浓度依赖性增加已构建的miRNA-1过表达的乳小鼠心肌细胞中GJA-1、KCNJ-2mRNA的表达。乳小鼠心肌细胞的GJA-1mRNA相对表达量分别为1.16±0.05,1.31±0.09,1.52±0.09,1.58±0.09; KCNJ-2mRNA相对表达量分别为1.14±0.04,1.21±0.04,1.39±0.04,1.40±0.04,与ago-miRNA-1组相比,均具有统计学差异(all P<0.05)。5. Western Blot检测Cx43与Kir2.1蛋白的表达,结果显示与空白对照组相比,ago-miRNA-1组蛋白表达明显下降,有统计学差异(P<0.05); ago-miRNA-1-NC组蛋白表达与空白对照组相比,无明显差异(P>0.05)。与ago-miRNA-1组相比,ago-miRNA-1+t-AUCB2,5,10,20μM组呈浓度依赖性升高已构建的miRNA-1过表达的乳小鼠心肌细胞中Cx43与Kir2.1蛋白的表达,除t-AUCB2μM组Kir2.1蛋白升高无统计学差异外,其余组升高均达统计学差异(P<0.05)。结论1.采用低浓度胰蛋白酶消化,结合差速贴壁及化学抑制两种方法,可以提高乳小鼠心肌细胞的成活率及纯度。2.200nM ago-miRNA-1为最适宜转染浓度,与空白对照组相比,ago-miRNA-1组乳小鼠心肌细胞]miRNA-1相对表达量明显升高,而ago-miRNA-1-NC组无明显差异,表明miRNA-1过表达细胞模型构建成功。3. t-AUCB可呈浓度依赖性地降低已构建的miRNA-1过表达的乳小鼠心肌细胞中miRNA-1的表达。另外,t-AUCB可呈浓度依赖性升高己构建的miRNA-1过表达的乳小鼠心肌细胞中GJA-1、KCNJ-2mRNA及其编码的Cx43与Kir2.1蛋白的表达。4.证实GJA-1、KCNJ-2为miRNA-1的靶基因；且t-AUCB可通过下调miRNA-1的表达,进而升高乳小鼠心肌细胞中GJA-1、KCNJ-2mRNA及Cx43与Kir2.1蛋白的表达,从而改善缺血性心律失常。