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研究背景乳腺癌（Breast cancer）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,也是女性癌症相关死亡的主要原因,目前治疗手段以手术切除、化疗、放疗和内分泌治疗为主,缺乏有效的靶向治疗导致了严重的不良预后反应,主要包括复发与转移,使乳腺癌患者的临床治疗面临巨大的挑战。因此,寻找与开发新的治疗方法和药物对于改善乳腺癌患者的预后势在必行。自噬是一种真核细胞内高度保守的自我调节过程,基于溶酶体降解细胞内聚集或错误折叠的蛋白质和衰老或受损的细胞器。在癌症进程中,自噬是一把“双刃剑”,一方面可以为癌细胞提供营养物质而延长其生存周期,另一方面自噬可以通过自身作用降解肿瘤细胞而抑制肿瘤的生长与转移。近年来,靶向自噬的一系列小分子在癌症的临床治疗中取得良好的进展。药物重定位是一种在已批准临床使用的药物中探索新机制或新用途的药物研发策略,与开发新药相比,药物重定位可以缩短药物研发的时间与成本,降低药物研发失败的风险。因此,药物重定位成为目前药物开发和研究的热点。作为FDA批准的广谱驱虫药物,氟苯达唑（Flubendazole）被重新定位为一种有效的抗癌药物与自噬诱导剂。然而,在乳腺癌中氟苯达唑诱导自噬的研究非常有限,其调控肿瘤增殖与转移的相关分子机制值得进一步探讨。研究目的本课题以乳腺癌为研究对象,探讨重定位药物氟苯达唑的抗癌作用并阐明氟苯达唑调控自噬及线粒体自噬相关的分子机制,为乳腺癌的临床治疗提供新的见解。研究方法1、通过MTT检测、克隆形成、LDH释放与Ed U检测研究氟苯达唑对乳腺癌细胞增殖的影响;2、通过Annexin V/PI双染与TUNEL检测研究氟苯达唑对乳腺癌细胞凋亡的影响;3、通过划痕与Transwell实验研究氟苯达唑对乳腺癌细胞迁移的影响;4、通过电镜与GFP-m RFP-LC3腺病毒分别观察乳腺癌细胞中自噬与自噬流;5、通过m PTP开放率与JC-1检测研究氟苯达唑对乳腺癌细胞线粒体膜的影响;6、通过流式分析检测Mito SOXTM Red FM研究氟苯达唑对线粒体氧化应激的影响;7、通过蛋白免疫印迹及免疫组化研究氟苯达唑对相关蛋白表达的影响;8、通过免疫荧光研究氟苯达唑对相关蛋白的荧光强度的影响及共定位情况;9、构建异种移植肿瘤模型与转移模型验证氟苯达唑在小鼠体内抑制增殖与转移的作用;10、通过RNAseq检测研究氟苯达唑诱导的乳腺癌细胞中差异表达基因。研究结果1、氟苯达唑诱导自噬相关性细胞死亡抑制乳腺癌增殖与转移在多种肿瘤细胞中评价氟苯达唑的抗癌作用并筛选出乳腺癌作为本研究的候选肿瘤,同时通过细胞水平研究与小鼠模型验证发现氟苯达唑具有抗增殖与抗转移作用。为进一步探究氟苯达唑抑制乳腺癌的分子机制,采用多种方法证明氟苯达唑在乳腺癌中能够诱导凋亡与自噬,并且在自噬缺陷细胞（si-ATG5）中或与自噬抑制剂（3-MA）联用将会降低氟苯达唑的抗增殖与抗转移效果,表明氟苯达唑诱导自噬相关性细胞死亡抑制乳腺癌增殖与转移。2、氟苯达唑靶向EVA1A诱导细胞自噬抑制乳腺癌增殖与转移采用RNAseq检测分析氟苯达唑诱导乳腺癌细胞转录组水平的变化并筛选自噬相关基因,结合细胞水平与小鼠体内验证氟苯达唑上调EVA1A的蛋白水平,而且,氟苯达唑靶向EVA1A调控自噬抑制乳腺癌增殖与转移。此外,结合基因敲除或过表达实验发现EVA1A调控ATG5依赖性自噬。3、氟苯达唑调控DRP1依赖性线粒体自噬诱导线粒体功能障碍研究发现氟苯达唑在乳腺癌细胞中破坏线粒体膜并引起线粒体功能障碍。通过进一步机制研究发现氟苯达唑能够上调DRP1的表达,促进PINK1的积累和Parkin的线粒体转位,激活PINK1/Parkin信号通路而诱导线粒体自噬。此外,抑制DRP1表达将降低氟苯达唑诱导的线粒体自噬,而且线粒体膜损伤和线粒体功能障碍得到缓解,表明氟苯达唑调控DRP1依赖性线粒体自噬并诱导乳腺癌细胞中线粒体功能障碍。4、氟苯达唑靶向EVA1A调控线粒体自噬抑制乳腺癌增殖与转移研究表明DRP1介导的线粒体自噬参与调控氟苯达唑诱导的抗癌作用。此外,本研究证明氟苯达唑在乳腺癌细胞靶向EVA1A调控线粒体自噬并诱导线粒体功能障碍。同时,结合基因敲除和过表达实验证明DRP1介导的线粒体自噬是EVA1A过表达发挥抗癌作用的关键因素之一,表明氟苯达唑靶向EVA1A调控线粒体自噬抑制乳腺癌增殖与转移。此外,初步分析氟苯达唑与EVA1A的结合模式,通过构建EVA1A突变位点并探究其对氟苯达唑诱导自噬与抗乳腺癌作用的影响,预测EVA1A的Thr113位点是其与氟苯达唑相互作用的潜在关键氨基酸位点。结论综上,本论文以乳腺癌为研究对象,探究重定位药物氟苯达唑在乳腺癌细胞与小鼠模型中的抗增殖与抗转移活性,并阐明氟苯达唑作为自噬诱导剂在乳腺癌中诱导自噬与线粒体自噬的相关机制。本研究报道了氟苯达唑在乳腺癌中靶向EVA1A调控自噬与线粒体自噬,诱导自噬相关性细胞死亡发挥抗增殖与抗转移作用。本论文为重定位药物氟苯达唑的抗癌作用提供新的见解,也为新型靶向抗乳腺癌小分子药物的开发提供新的线索。