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卵菌是一类真核生物,包括许多重要的植物和动物病原菌。其中疫霉属包含许多引起作物毁灭性病害的病原菌,如19世纪中叶危害马铃薯引起爱尔兰大饥馑的致病疫霉（Phytophthora infestans （Montagne） de Bary）,引起大豆疫霉根腐病且平均每年给全世界大豆生产造成约10-20亿美元的经济损失的大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufman&Gerdman）等。迄今为止,由于对疫霉菌致病机制方面的了解匮乏,使得作物疫病一直是农业生产的一个威胁。对大豆疫霉全基因组进行生物信息学分析,发现其基因组中编码近400个RxLR类效应分子,相比于其他植物病原菌,如此数量庞大的效应分子家族暗示了寄主植物和疫霉菌之间存在复杂的防卫/反防卫关系。尽管一些效应分子已被发现能够抑制植物的防卫反应,但绝大部分效应分子在侵染过程中的毒性功能及其作用机制仍然未知。RNA沉默（RNA silencing）是植物、真菌以及无脊椎动物等抵御病毒侵染的重要机制。病毒通过编码RNA沉默抑制子（Viral Suppressors of RNA silencing,VSRs）能够抑制寄主的基因沉默,帮助病毒侵染。由small RNA介导的转录后基因沉默（Post-Transcriptional Gene Silencing, PTGS）是寄主抵御细菌的重要机制,并且发现细菌中一些效应分子也能作为RNA沉默抑制子（BSRs）来抑制寄主的基因沉默。本实验室发现大豆疫霉两个RxLR效应分子是植物RNA沉默抑制子,分别命名为PSRl和PSR2（Phytophthora Suppressors of RNA silencing 1 and 2）,且具有不同的抑制沉默机制。本论文主要对P. sojae PSR2 （PsPSR2）效应分子及其同源效应分子的功能进行深入分析,获得了如下研究结果：1. PsPSR2-like基因在疫霉菌中的生物信息学鉴定与进化分析。分析了8个疫霉物种（大豆疫霉（P. sojae）,辣椒疫霉（Phytophthora capsici）,致病疫霉（P. infestans）,寄生疫霉（Phytophthora parasitica）,橡树疫霉（Phytophthora ramorum）,樟疫霉刺槐变种（Phytophthora cinnamomi var. robiniae）,瓜类疫霉（Phytophthora melonis）和荔枝疫霉（Phytophthora litchi））的全基因组序列,发现在所检测的每个疫霉物种中均存在PsPSR2-like基因,这在具有丰富多态性的RxLR效应分子家族中是罕见的。所有这些PsPSR2-like基因编码的蛋白都含有保守的N端信号肽和RxLR序列元件,表明它们都是胞内效应分子,且在活体营养型卵菌Hyaloperonospora arabidopsidis也发现一个PsPSR2-like基因,含有保守的N端信号肽和dEER-like序列元件,以上强有力地说明RxLR效应分子PsPSR2广泛分布于疫霉属,且有可能分布于其他卵菌病原菌中。PsPSR2-like基因分为三个系统进化分枝,这与基于ITS序列建立的疫霉的物种进化分化树是高度一致的,说明PsPSR2-like效应分子在进化上是高度保守的,并且和疫霉物种分化是同步的。多态性分析发现PsPSR2在大豆疫霉的四个主要生理小种（Race 2、 Race 7、Race 17和Race 19）的代表性菌株间没有多态性。并且对PsPSR2的结构域分析发现它含有5个串联的L-W-Y复合体结构,并且在PsPSR2-like基因中也大都有这样重复排列结构,且W-Y结构被证明与α-螺旋折叠相关,说明PsPSR2可能通过形成这些重复结构,使蛋白结构复杂化来逃避寄主的识别。2. PsPSR2效应分子的毒性功能研究。前期已有研究表明大豆疫霉PsPSR2效应分子能抑制植物RNA沉默反应,这种抑制作用与大豆疫霉侵染能力是否存在关联值得研究。在大豆疫霉中瞬时沉默PsPSR2,发现大豆疫霉对大豆下胚轴的侵染能力显著减弱,表明PsPSR2是一个毒性因子。接着我们用大豆疫霉菌株P6497的GFP转化菌株监控观察大豆疫霉侵染大豆根系的过程,经实时定量检测发现PsPSR2主要在侵染后期即菌丝扩展和卵孢子形成阶段高度上调表达。定位观察发现PsPSR2主要定位在烟草细胞的细胞质与细胞核中。随后,由发根农杆菌介导在大豆中瞬时表达PsPSR2,发现表达PsPSR2的大豆发状根对大豆疫霉更加感病。先前研究证明表达PsPSR2拟南芥植株中与植物抗病反应相关的ta-siRNA的生物合成受到抑制,但是PsPSR2是否促进病原菌对拟南芥的侵染还不清楚,因此,我们成功建立了拟南芥与辣椒疫霉的亲和互作体系,并发现ta-siRNA合成受抑的PsPSR2-5和PsPSR2-10转基因拟南芥株系对辣椒疫霉更为敏感,但ta-siRNA合成正常的PsPSR2-18株系对辣椒疫霉的敏感性没有显著变化,说明PsPSR2可能通过与特定的ta-siRNA结合来抑制RNA沉默,从而促进疫霉的侵染。此外,我们还发现PsPSR2转基因拟南芥植株中PR1基因表达受抑制,说明PsPSR2促进侵染还可能是通过干扰植物中依赖于水杨酸的防卫途径。综上所述,PsPSR2效应分子可通过抑制寄主植物（大豆、拟南芥等）的RNA沉默途径及与其他防卫途径相互作用来发挥毒性功能。3.PsPSR2-like基因的功能分析研究。PsPSR2在疫霉属中的广泛分布性以及进化上的保守性,促使我们想了解它们的功能是否也保守。我们通过生物信息学分析选取了6个PsPSR2同源基因来鉴定它们的RNA沉默抑制活性,结果表明致病疫霉中与PsPSR2亲缘关系最近的PITG15152同样能够抑制植物内的RNA沉默效应,且抑制程度强于PsPSR2。该蛋白在结构上仅比PsPSR相差一个L-W复合体,亚细胞定位及在侵染阶段的表达谱与PsPSR2相似,由此命名为PiPSR2.当在致病疫霉中沉默PiPSR2后,沉默转化子在生长及休止孢萌发率等表型没有变化,但对本氏烟草的致病力显著减弱,表明PiPSR2致病疫霉的一个毒性因子。同时,在烟草中瞬时表达PiPSR2后,显著促进了致病疫霉菌对烟草的侵染。以上结果表明PsPSR2-like效应分子可能是疫霉菌中一类基本的毒性因子,通过抑制植物的RNA沉默途径来干扰植物对疫霉菌的抗病性。为了进一步研究PiPSR2在抑制RNA沉默反应中的具体的作用机制,我们已经成功获得了PiPSR2的转基因拟南芥植株,为以后的深入研究奠定了基础。综上所述,PsPSR2-like效应分子是一类在进化上较为保守的RxLR效应分子,广泛分布于整个疫霉属乃至其他部分植物病原卵菌中,可通过抑制植物体内的RNA沉默途径来发挥其保守的毒性功能。