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特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)是儿科最常见的出血性疾病。目前普遍认为ITP发病机制主要是因为免疫因素致机体产生血小板相关抗体，使血小板及巨核细胞(megakaryocyte，MK)被单核-巨噬细胞系统所清除，从而导致血小板减少。检查发现，虽然ITP骨髓巨核细胞数正常或增多，但产血小板的巨核细胞减少，幼稚颗粒型的巨核细胞明显增多，提示ITP患者存在有巨核细胞成熟障碍。临床通常将其病程是否超过6个月分为急性ITP(acute idiopathic thrombocytopenic purpura，AITP)与慢性ITP(chronic idiopathic thrombocytopenic purpura，CITP)两型。AITP与CITP在发病早期鉴别存在难度，从而无法在疾病早期分别给予针对性的积极有效治疗。部分CITP患儿对糖皮质激素或大剂量静脉丙种球蛋白治疗反应差，病情迁延反复，发展为难治性ITP，给患儿身心健康造成极大的威胁。巨核细胞是血小板的前体细胞，研究巨核细胞的改变对了解血小板减少性疾病发生的原因及其鉴别诊断、预后判断与治疗方案的选择有很大的科研价值和临床意义。血小板生成包括造血干细胞增殖分化产生巨核细胞，巨核细胞的分化成熟，血小板的生成，多个细胞因子和转录因子参与了该过程。在巨核系造血的早期阶段，主要由血小板生成素(thrombopoietin，TPO)及白细胞介素1(interleukin 1，IL-1)、IL-3调控；在分化的后期有TPO、IL-6和IL-11参与。GATA-1与红细胞系核因子2(nuclear factor erythroid 2，NF-E2)是调节造血细胞基因转录的转录因子(transcription factor)，二者在调控巨核细胞发育分化方面起重要作用。IL-11是重要的造血调节因子，可刺激巨核系造血，促进巨核细胞的成熟。但目前尚未有重组人白细胞介素11(recombinant human interleukin 11，rhIL-11)治疗ITP等自身免疫性血小板减少性疾病的确切资料。而IL-11是否参与巨核细胞生长调控的信号转导，与调控巨核细胞生成的转录因子之间有无关系尚未可知，目前无相关研究资料。本研究分三部分内容，首先，在rhTPO、rhIL-3、rhIL-6等细胞因子作用下，对骨髓巨核系祖细胞集落进行体外无血清半固体培养。通过观察对照组及ITP患儿巨核系祖细胞的生长，并比较ITP不同病程中巨核系祖细胞生长的差异，探讨巨核细胞生成在ITP发病机制中的作用。第二，观察rhIL-11联合其它因子对对照组和CITP组巨核系祖细胞生长成熟的作用，并比较在无血清液体培养条件下对单个核细胞(mononuclear cells，MNC)以及CD41~+细胞的增殖效力，旨在探讨rhIL-11在CITP治疗中的作用。第三，观察rhIL-11诱导Dami细胞GATA-1和NF-E2的mRNA及蛋白表达变化，旨在阐明rhIL-11对巨核细胞生长调控的信号转导机制。第一部分ITP患儿骨髓巨核系祖细胞体外培养的研究对象和方法1．初治ITP患儿52例，分别于治疗前抽取骨髓3ml～4ml进行检验。其中AITP患儿27例，CITP患儿25例。同时，对25例CITP患儿给予口服强的松治疗2.0mg／(kgd)，疗程不超过28天。根据疗效不同分为激素有效组和激素无效组。对照组为骨髓检查三系造血功能正常，排除血液系统疾病儿童10例。2．骨髓涂片巨核细胞(MK)标化计数。3．骨髓MNC分离：用Ficoll密度梯度分离法分离骨髓MNC。4．骨髓巨核系祖细胞的半固体培养：骨髓MNC接种于含有rhTPO、rhIL-3、rhIL-6无血清胶原培养基培养14天。5．巨核系祖细胞的染色鉴定：以CD41结合的碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase，APAAP)桥联酶标法染色鉴定半固体培养的巨核细胞集落形成单位(megakaryocyte colony forming unit，CFU-MK)和巨核细胞爆式集落形成单位(megakaryocyte burst forming unit，BFU-MK)。6．用统计学分析软件SPSS13.0进行统计学分析。结果1．各组骨髓MK数的比较：AITP组骨髓MK较对照组显著增高(P＜0.05)，CITP组MK较对照组显著增高(P＜0.05)，AITP组与CITP组相比，MK差异无显著性(P＞0.05)。25例CITP患儿中，17例激素有效组MK均高于对照组和8例激素无效组(均为P＜0.05)；激素无效组MK低于对照组(P＜0.05)。2．各组骨髓巨核系祖细胞集落数的比较：AITP组CFU-MK和BFU-MK均高于对照组(均为P＜0.05)，CITP组CFU-MK和BFU-MK与对照组相比差异无显著性(均为P＞0.05)，CITP患儿中激素有效组CFU-MK和BFU-MK均高于对照组和激素无效组(均为P＜0.05)；激素无效组CFU-MK和BFU-MK均低于对照组(均为P＜0.05)。3．相关性分析：AITP组CFU-MK和MK有显著相关性(r_s=0.65，P＜0.01)，BFU-MK和MK有显著相关性(r_s=0.71，P＜0.01)，CFU-MK和BFU-MK有显著相关性(r_s=0.74，P＜0.01)。CITP组CFU-MK和MK有显著相关性(r_s=0.90，P＜0.01)，BFU-MK和MK有显著相关性(r_s=0.98，P＜0.01)，CFU-MK和BFU-MK有显著相关性(r_s=0.92，P＜0.01)。第二部分rhIL-11对慢性ITP患儿骨髓巨核系祖细胞体外培养的作用对象和方法1．取第一部分中23例CITP患儿骨髓，其中15例激素有效患儿为激素有效组，8例激素无效患儿为激素无效组，取第一部分中10例对照组儿童骨髓为对照组。2．骨髓MNC分离：用Ficoll密度梯度分离法分离骨髓MNC。3．骨髓巨核系祖细胞的半固体培养：骨髓MNC接种于无血清胶原培养基培养14天，培养体系中包含rhIL-11，或者rhTPO、rhIL-3、rhIL-6，或者rhTPO、rhIL-3、rhIL-6、rhIL-11。4．巨核系祖细胞的染色鉴定：以CD41单克隆抗体结合的APAAP桥联酶标法染色鉴定半固体培养的CFU-MK和BFU-MK。5．骨髓巨核系祖细胞的液体培养：无血清液体培养各组骨髓MNC，培养体系中包含rhIL-11，或者rhTPO、rhIL-3、rhIL-6，或者rhTPO、rhIL-3、rhIL-6、rhIL-11。6．MNC的检测：无血清液体培养第0、7、14天，白细胞计数板行MNC计数。7．CD41~+细胞率的检测：无血清液体培养第14天，流式细胞仪测定CD41~+细胞率。8．用统计学分析软件SPSS13.0进行统计学分析。结果1．rhIL-11联合TPO等对各组骨髓巨核系祖细胞集落生长的作用：rhIL-11可促进对照组CFU-MK和BFU-MK生成(均为P＜0.01)，并可促进激素有效组CFU-MK和BFU-MK生成(均为P＜0.01)；对激素无效组CFU-MK和BFU-MK则无明显影响(均为P＞0.05)。2．rhIL-11联合TPO等对各组MNC的增殖作用：在培养第7、14天，rhIL-11对各组MNC均无显著增殖作用(均为P＞0.05)。3．rhIL-11联合TPO等对各组CD41~+细胞的增殖作用：培养14天，rhIL-11可显著扩增对照组、激素有效组CD41~+细胞百分率(均为P＜0.01)，对激素无效组无显著增殖作用(P＞0.05)。第三部分rhIL-11诱导转录因子GATA-1和NF-E2在Dami细胞的表达对象和方法1．Dami细胞生长曲线的建立：取对数生长期Dami细胞，连续培养7天，每天进行细胞计数，绘制生长曲线。2．rhIL-11对Dami细胞的增殖作用：取对数生长期Dami细胞，CCK-8(Cell Counting Kit-8)法分别于培养0h、24h、48h、72h进行检测。3．Dami细胞IL-11Rα的表达：免疫组化法检测Dami细胞IL-11Rα的表达。4．Dami细胞IL-11Rα蛋白表达：Western blot法检测Dami细胞IL-11Rα蛋白表达。5．Dami细胞GATA-1和NF-E2的mRNA表达：用rhIL-11(50ng／ml)刺激Dami细胞0h、1h、2h、4h，RT-PCR法对rhIL-11诱导的Dami细胞GATA-1和NF-E2的mRNA表达进行检测。6．Dami细胞GATA-1和NF-E2蛋白表达：用rhIL-11(50ng／ml)刺激Dami细胞1h、2h、4h，Western blot法分析rhIL-11诱导的Dami细胞GATA-1和NF-E2蛋白表达。7．用统计学分析软件SPSS13.0进行统计学分析。结果1．rhIL-11对Dami细胞增殖的影响：浓度分别为50ng／ml和100ng／ml的rhIL-11在培养24h、48h、72h对Dami细胞增殖均无促进作用(P＞0.05)。2．免疫组化法检测发现，Dami细胞表达IL-11Rα。3．Western Blot检测发现，Dami细胞表达IL-11Rα蛋白。4．rhIL-11诱导Dami细胞GATA-1和NF-E2的蛋白表达：Western Blot检测发现：50ng／ml rhIL-11处理后1h、2h、4h，GATA-1和NF-E2蛋白表达量均高于0h(均为P＜0.01)。5．rhIL-11诱导Dami细胞GATA-1和NF-E2的mRNA表达：RT-PCR检测发现：50ng／ml rhIL-11处理后1h，GATA-1mRNA表达高于0h(P＜0.01)，但2h、4h GATA-1mRNA表达低于0h(均为P＜0.01)。而在rhIL-11处理后1h、2h、4h，NF-E2mRNA表达均高于0h(均为P＜0.01)，且NF-E2mRNA在1h表达高于2h和4h(均为P＜0.01)。结论1．在发病早期综合分析ITP患儿骨髓巨核细胞和体外巨核系祖细胞集落的生成情况，可能有助于AITP和CITP的早期鉴别诊断。2．部分CITP患儿巨核系祖细胞集落减低，对糖皮质激素治疗反应差，可能存在巨核细胞增生障碍。3．与TPO等细胞因子联合进行体外培养发现，rhIL-11可促进部分CITP患儿骨髓巨核系祖细胞的增殖，提示rhIL-11具有治疗CITP的潜在价值；但对巨核系祖细胞具有明显增殖障碍的部分CITP患儿无明显作用。4．rhIL-11可促进Dami细胞GATA-1和NF-E2的mRNA及蛋白表达，提示rhIL-11可能通过诱导这些转录因子来调控巨核细胞的增殖和分化。rhIL-11可能是通过与Dami细胞表面的IL-11Rα结合而发挥作用的。