肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌）是最常见的恶性肿瘤之一，以高转移潜能和低治愈率为特点，传统的治疗方法能够切除瘤组织但不易根治最终导致肝癌复发。淋巴道转移(lymphatic metastasis)是肝癌转移的主要方式，是一个复杂且多因素调控的动态过程。越来越多的证据表明，存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体，具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能;这些细胞被认为是肿瘤起始的根源，在维持肿瘤细胞生长及促进肿瘤转移中起决定性作用，即肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)。研究表明，肝癌干细胞(hepatic cancer stem cells，HCSCs)与肝癌的发生发展、增殖、侵袭转移关系极其密切。肝癌的发生和转移等过程涉及到肝癌干细胞及其所处的微环境中众多复杂的信号通路，这些信号通路的激活及相互作用一定程度上介导了肝癌转移、侵袭及肝癌干细胞在血液/淋巴循环系统中的存活、转移靶部位生长等过程。因此，对于肝癌干细胞和肝癌淋巴道转移的相关研究将有助于鉴定到有意义的治疗靶点，深入了解肝癌转移机制，为肝癌的临床诊断和治疗奠定基础。　　 利用特异性表面标记分选肝癌干细胞是研究肝癌干细胞的前提。近年来，CD133作为多种组织肿瘤包括肝癌在内的细胞表面独立表达的特异标记分子可以对干细胞、前体细胞和肿瘤干细胞进行分选。众多研究表明，CD133表达阳性的肿瘤干细胞与肿瘤的自我更新、分化潜能、信号传导调控、药物耐受、转移复发和预后等有一定相关性。本研究选用来源同一亲本但淋巴道转移潜能显著不同的小鼠腹水型肝癌细胞株Hca-F和Hca-P为研究对象，其中Hca-F具有高淋巴道转移潜能，淋巴结转移率超过70％;Hca-P具有低淋巴道转移潜能，淋巴结转移率低于30％，二者是研究肝癌淋巴道转移机制较理想的细胞株模型。首先，在无血清条件下培养肝癌干细胞球并采用流式细胞术检测Hca-F和Hca-P细胞株中CD133+细胞数量，初步探讨Hca-F和Hca-P中肝癌干细胞球的数量及肝癌干细胞比例与肝癌淋巴道转移的关系。然后，以CD133作为表面标记物采用免疫磁珠(magnetic activated cell sorting，MACS)法分选小鼠肝癌细胞株Hca-F和Hca-P中CD133+肝癌干细胞和CD133-细胞，通过比较其体外增殖能力、迁移和侵袭能力及体内成瘤能力等生物学特征，探讨CD133+肝癌干细胞与肝癌淋巴道转移的相关机制。肝癌淋巴道转移是一个多基因参与、多步骤形成且机制复杂的过程。为此，检测与肿瘤淋巴道转移相关蛋白AnnexinⅦ、JNK和E-cadherin(CDH1)在CD133+肝癌干细胞和CD133-细胞及肿瘤组织中的表达情况，研究其与肝癌淋巴道转移的潜在关系。最后探讨了JNK信号转导通路在CD133+肝癌干细胞淋巴道转移潜能中的作用机制。　　 第一部分Hca-F和Hca-P细胞株中肝癌干细胞数量及克隆能力的比较　　 目的:比较Hca-F和Hca-P细胞株中肝癌干细胞数量及克隆能力。　　 方法:Hca-F和Hca-P培养在无血清DMEM/F12中培养10天，肝癌干细胞球形成并比较其在Hca-F和Hca-P中的数量。同时，以CD133为表面标记采用流式细胞仪检测CD133阳性细胞在Hca-F和Hca-P中的比例。　　 结果:肝癌干细胞球形成实验结果显示Hca-F产生70.0±8.7个肝癌干细胞球，而Hca-P产生46.0±8.0个肝癌干细胞球，提示Hca-F产生的肝癌干细胞球多于Hca-P产生的肝癌干细胞球(p＜0.05)。流式细胞仪检测发现Hca-F细胞中CD133+细胞约占细胞总数的20.17±4.35％，Hca-P细胞中CD133+细胞约占细胞总数的15.26±2.73％，结果提示Hca-F中CD133+细胞数量是Hca-P中的1.3倍(p＜0.05)。　　 结论:Hca-F比Hca-P中肝癌干细胞球数量多，提示高转移潜能细胞株Hca-F比低转移潜能细胞株Hca-P具有更强的自我更新和克隆能力。肝癌淋巴道转移潜能可能与肝癌干细胞数量及克隆能力有关。　　 第二部分Hca-F和Hca-P中CD133+肝癌干细胞的分选及体外增殖、迁移和侵袭能力比较　　 目的:比较Hca-F和Hca-P中CD133+肝癌干细胞体外的增殖、迁移和侵袭能力。　　 方法:Hca-F和Hca-P细胞经过10天的无血清培养，肝癌干细胞球形成。以CD133为表面标记采用免疫磁珠分选方法分选Hca-F和Hca-P中CD133+肝癌干细胞，得到四组细胞，分别简记为Hca-F-CD133+、Hc a-F-CD133-、Hca-P-CD133+和Hca-P-CD133-。采用CCK8增殖实验、Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验比较四组细胞体外增殖、迁移和侵袭能力等生物学行为的变化。　　 结果:　　 1.CCK8增殖实验结果显示Hca-F-CD133-组细胞数量是Hca-F-CD133+组细胞数量的97％(24h)、83％(48h)、75％(72h)和63％(96h);Hca-P-CD133-组细胞数量是Hca-P-CD133+组细胞数量的95％(24h)、97％(48h)、83％(72h)和79％(96h);Hca-P-CD133+组细胞数量是Hca-F-CD133+组细胞数量的98％(24h)、81％(48h)、86％(72h)和74％(96h)。　　 2.Transwell迁移实验结果显示Hca-F-CD133+组(280.03±19.75)穿过滤膜的细胞数量显著多于Hca-F-CD133-组（170.40±12.87）穿过滤膜的细胞数量(p＜0.05);Hca-P-CD133+组（178.03±11.60）穿过滤膜的细胞数量显著多于Hca-P-CD133-组（92.27±9.83）穿过滤膜的细胞数量(p＜0.05)。Hca-F-CD133+组（280.03±19.75）穿过滤膜的细胞数量显著多于Hca-P-CD133+组(178.03±11.60)穿过滤膜的细胞数量(p＜0.05)。　　 3.Transwell侵袭实验结果显示Hca-F-CD133+组（147.13±9.38）穿过滤膜的细胞数量显著多于Hca-F-CD133-组(111.03±10.06)穿过滤膜的细胞数量(p＜0.05);Hca-P-CD133+组（95.47±14.10）穿过滤膜的数量显著多于Hca-P-CD133-组（85.00±8.93）穿过滤膜的细胞数量(p＜0.05)。Hca-F-CD133+组(147.13±9.38)穿过滤膜的细胞数量显著多于Hca-P-CD133+组(95.47±14.10)穿过滤膜的细胞数量(p＜0.05)。　　 结论:不论是Hca-F细胞株还是Hca-P细胞株中，CD133+肝癌干细胞都较CD133-细胞有着更强的增殖，迁移和侵袭能力。而高转移细胞株Hca-F中CD133+肝癌干细胞比低转移细胞株Hca-P中CD133+肝癌干细胞有着更强的增殖、迁移和侵袭潜能。　　 第三部分 Hca-F和Hca-P中CD133+肝癌干细胞裸鼠体内成瘤能力比较　　 目的:比较Hca-F和Hca-P中CD133+肝癌干细胞体内成瘤能力。　　 方法:将新鲜分选的Hca-F-CD133+、Hca-F-CD133-、Hca-P-CD133+和Hca-P-CD133-四组细胞制成细胞悬液后按浓度为5x105/50μl接种到裸鼠体内，将20只裸鼠随机分成4组，每只裸鼠于背侧皮下接种100μl细胞悬液。接种后第6d，9d，12d，15d，18d和21d观察各组肿瘤形成的生长速度并测量肿瘤体积。接种后第21天以颈椎脱臼法处死裸鼠并取出瘤体，观察比较四组细胞的成瘤能力，采用免疫组化方法检测了与肿瘤淋巴道转移相关蛋白AnnexinⅦ和E-cadherin在肿瘤组织中的表达情况。　　 结果:Hca-F-CD133+组的成瘤能力显著高于Hca-P-CD133+组;Hca-P-CD133+组的成瘤能力显著高于Hca-P-CD133-组;Hca-F-CD133+组的成瘤能力显著高于Hca-F-CD133-组(P＜0.05)。免疫组化结果提示Hca-F和Hca-P两个细胞株中，AnnexinⅦ和E-cadherin两种蛋白在CD133+肿瘤干细胞中的表达均低于在CD133-细胞中的表达。　　 结论:高淋巴道转移细胞株Hca-F中CD133+肝癌干细胞比低淋巴道转移细胞株Hca-P中CD133+肝癌干细胞有着更强的成瘤能力，提示肝癌干细胞的成瘤能力可能是决定肝癌淋巴道转移潜能的关键原因之一。AnnexinⅦ和E-cadherin可能与肝癌干细胞高成瘤性相关。　　 第四部分JNK信号转导通路在CD133+肝癌干细胞淋巴道转移潜能中的作用　　 目的:检测AnnexinⅦ、JNK和E-cadherin三种蛋白在Hca-F和Hca-P两个细胞株CD133+肝癌干细胞及CD133-细胞中的表达情况，探讨JNK信号转导通路在CD133+肝癌干细胞淋巴道转移潜能中的作用。　　 方法:采用western blot方法检测与肝癌淋巴道转移相关的蛋白AnnexinⅦ、JNK和 E-cadherin在 Hca-F-CD133+、 Hca-F-CD133-、 Hca-P-CD133+和Hca-P-CD133-四组细胞中的表达情况。应用GeneGo软件创建关于AnnexinⅦ、JNK和CDH1(E-cadherin)的network及pathway。　　 结果:AnnexinⅦ、JNK和E-cadherin三种与肝癌淋巴道转移相关蛋白在CD133+肝癌干细胞中的表达均低于在CD133-细胞中的表达。Network提示:JNK是连接E-cadherin(CDH1)和AnnexinⅦ关键的连接点。JNK/P53/AnnexinⅦ和JNK/ATF-2/CDH1/AnnexinⅦ两条信号通路最终都作用于核外的AnnexinⅦ基因，参与CD133+肝癌干细胞淋巴道转移过程。　　 结论:AnnexinⅦ、JNK和E-cadherin(CDH1)在肝癌淋巴道转移中可能起到抑癌基因作用。JNK信号转导通路在CD133+小鼠腹水型肝癌淋巴道转移的过程中起重要作用。