研究背景及目的自噬(autophagy)是一个降解和回收大分子和细胞器的分解代谢过程,通常在压力条件下被激活。自噬首先由双层膜泡结构的自噬体形成开始,然后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,最后在自噬溶酶体中溶酶体水解酶消化囊泡中回收的内容物。自噬体形成是一个三步过程:启动阶段;自噬小体的形成与延伸阶段;白噬溶酶体的成熟与降解阶段。自噬在细胞中通常保持基础水平,以维持细胞合成代谢及分解代谢平衡,而当细胞遭遇营养缺乏、缺氧等各种应激时,自噬作为促存活机制被激活。自噬在细胞中受到了多种因子和信号通路的精密调节,且与凋亡及其他细胞活动有着密切联系。快速生长肿瘤的微环境常出现低氧、高酸和缺乏营养等情况,当肿瘤细胞面对诸如此类的不利因素,特别是使用化疗药物杀伤肿瘤细胞后,自噬可能通过自噬分解受损伤细胞器及蛋白维持细胞稳态。某些抗肿瘤药物可以诱导肿瘤细胞发生自噬,并参与自噬的分子调控,同时自噬也可能导致肿瘤细胞凋亡。抗肿瘤药物引起肿瘤细胞发生的自噬与药物的种类和浓度、肿瘤细胞的类型及药物作用于肿瘤细胞的时间等因素有关。根据自噬的特点,药物诱导肿瘤细胞发生自噬后会产生两大类不同的结果:一类是保护细胞免受周围环境造成的损害;另一类是激发细胞主动性启动II型细胞死亡程序。虽然目前对于这两种不同结果的产生还没有发现特定的规律,但在癌症治疗过程中,各种常规化疗药物结合自噬抑制剂的组合疗法,已被广泛应用并成为一个有吸引力且有前途的方法。在癌症治疗中此种组合疗法的优势在于可以增强恶性肿瘤对化疗药物的敏感性,同时也有一个基本前提,即自噬在这些化学治疗的抗癌作用中发挥保护剂作用。有研究表明,自噬至少有4种功能形式,可能会发生在对化疗药物中的反应中,具体方式与癌细胞系类型和化疗药物的种类有关。这4种功能形式分别是:细胞保护作用,细胞生长抑制作用,细胞毒性作用和无保护作用。因此,在自噬诱导类抗肿瘤药物应用于临床试验前,明确其诱导自噬的功能类型,并进一步确定其作用机制是非常必要的。闭苞买麻藤是一种中草药,生长在中国云南省的西南部,用于治疗关节炎,支气管炎,心脑血管系统疾病和包括膀胱癌在内的一些癌症,已有数百年历史。异丹叶大黄素isorhapontigenin(iso)是从中草药闭苞买麻藤中分离出的一种新的芪类衍生物。因为天然低聚芪具有包括抗癌活性在内的多方面生物学特性,研究人员给予其越来越多的关注。我们之前的研究表明,iso能够通过多种机制诱导肿瘤细胞生长抑制和凋亡。如iso可以通过下调抗凋亡蛋白xiap表达诱导多种人类肿瘤细胞系的凋亡反应,也能够抑制膀胱癌细胞增殖,下调细胞周期蛋白cyclind1表达,诱导g0/g1期细胞周期阻滞,抑制细胞的迁移能力。然而,很少有研究涉及iso对肿瘤细胞的自噬诱导作用及其分子机制。sestrin2(sesn2)是编码sestrin家族pa26相关蛋白的成员之一,它在抑制氧化应激和ampk-mtor信号通路的调控中起着重要作用。sesn2蛋白也参与不同压力条件细胞活力的复杂调节。本研究中我们发现,iso处理能有效诱导sesn2依赖性自噬,并且该自噬是iso诱导的癌症细胞非贴壁克隆生长抑制所必需的,这表明对人膀胱癌细胞来说,iso诱导的自噬是发挥细胞生长抑制作用的。我们还发现,sesn2在人膀胱癌组织中显著下调,动物实验结果表明,iso处理组与bbn诱导膀胱癌组的小鼠比较,其膀胱组织中sesn2蛋白表达升高。本课题研究的目的是在已有的研究基础上,深入探讨抗肿瘤化合物iso介导肿瘤细胞自噬的分子机制,为iso的抗癌特性提供新的分子基础。研究内容及方法1、通过westernblotting方法检测iso作用后不同肿瘤细胞自噬标志性蛋白lc3的蛋白表达变化,初步了解iso诱导自噬的剂量和程度;检测iso处理后自噬通路蛋白的表达水平;检测与sesn2启动子区结合的转录因子的蛋白表达情况;检测c-jun显性负突变体tam67过表达及shc-junumuc3与其相应对照细胞株中磷酸化c-jun、sesn2和lc3的表达差异;检测umuc3/helashjnk1和nonsense对照细胞中iso处理后phospho-jnkt183/y185、jnk、phospho-c-juns63、c-jun、sesn2和lc3表达的变化;检测人膀胱癌组织及癌旁组织中sesn2的表达差异。2、通过polyjet细胞转染法建立稳定转染gfp-lc3的细胞株,应用免疫荧光法观察gfp-lc3的点状聚集,验证iso的自噬诱导效应;建立shbecn1和shsesn2稳定转染细胞株,在转染shrna的肿瘤细胞株中观察自噬通路蛋白表达被抑制后对iso诱导自噬的影响;建立tam67过表达umuc3细胞株,构建并转染荧光素酶报告基因质粒sesn2-luc,用荧光素酶报告基因检测法检测umuc3tam67和vector对照细胞中iso诱导的ap-1和sesn2启动子的转录活性的变化;建立稳定转染shjnk1的umuc3细胞株,转染荧光素酶报告基因质粒sesn2-luc,用荧光素酶报告基因检测法检测sesn2启动子转录活性的变化。3、用anchorage-independentgrowthassay观察自噬抑制剂baf对iso诱导的细胞克隆形成抑制的影响;比较umuc3shrnasesn2与nonsense对照细胞中iso处理后对细胞克隆形成的影响;比较umuc3tam67过表达、shc-jun及shjnk1umuc3细胞株与相应对照细胞株中iso处理对细胞克隆形成的影响。4、通过rt-pcr检测sesn2mrna水平的变化;检测tam67过表达、shjnk1umuc3细胞株与对照细胞株中iso处理后sesn2mrna水平的变化。5、用染色质免疫沉淀法(chip)检测转录因子c-jun与sesn2启动子序列的特异性结合作用。6、用免疫组化法(ihc)观察bbn诱导膀胱癌小鼠组织sesn2蛋白表达情况。研究结果一、iso可诱导人肿瘤细胞发生自噬1、iso处理可诱导人膀胱癌细胞系umuc3,t24t及人宫颈癌hela细胞系发生自噬,表现为随着iso剂量的增加,自噬的标志物lc3-i向lc3-ii的转化也增加。2、iso处理稳定转染gfp-lc3的umuc3细胞,用荧光显微镜可以观察到gfp-lc3点状聚集以剂量依赖的方式逐渐增多。3、自噬抑制剂baf可以使iso处理导致的lc3-ii蛋白水平及gfp-lc3点状聚集进一步增加,表明iso能够增加自噬流;baf也可以明显削弱iso对umuc3细胞非贴壁克隆生长的抑制效应。二、iso通过刺激自噬相关基因sesn2高表达诱导肿瘤细胞发生自噬1、对于umuc3细胞,自噬诱导剂量的iso处理可增加beclin1和sesn2的表达水平。然而,稳定转染shrnabeclin1的umuc3细胞未能阻断iso诱导的lc3的转换,稳定转染shrnasesn2的umuc3细胞却使iso引起的lc3转化明显减弱。2、在shrnasesn2umuc3与nonsenseumuc3对照细胞中观察iso对肿瘤细胞非贴壁克隆生长的影响。在nonsense对照细胞中5μm和10μmiso处理能明显减少肿瘤细胞克隆形成;而在shrnasesn2转染细胞中,iso对细胞克隆形成没有明显影响。三、c-jun在iso诱导sesn2表达及肿瘤细胞生长抑制中起重要作用1、iso处理以剂量依赖性方式增加sesn2mrna的表达;同时,iso处理后sesn2转录活性也增强。2、对iso处理后sesn2近端启动子区多个转录因子的表达变化进行westernblotting分析,磷酸化nfκb,总nfκb,sp-1和e2f1的表达水平在iso作用后没有改变或只显示轻微改变,而c-jun的活性形式——磷酸化c-jun表达被明显上调。3、c-jun显性负突变体tam67过表达可以明显阻断iso诱导的ap-1的活性和sesn2启动子活性,同时,rt-pcr和荧光素酶报告基因检测分析进一步揭示了tam67能有效阻止sesn2在转录水平的升高。4、染色质的免疫沉淀实验表明sesn2启动子可与转录因子c-jun相互作用并结合,且这种相互作用在iso处理后增强。5、转染tam67过表达或shc-jun质粒均可显著降低iso处理引起的c-jun磷酸化、sesn2诱导表达和lc3-ii的形成,并抑制iso处理导致的umuc3细胞集落形成减少。四、jnk是iso诱导c-jun依赖的sesn2激活的上游通路激酶1、iso诱导c-jun激活以及lc3-ii升高的同时也观察到jnk激活。shrnajnk1不仅阻断了iso引起的c-jun活化,同时也减弱了sesn2的诱导升高并抑制了lc3-ii的形成;shrnajnk1也可以完全阻断iso处理后sesn2mrna的诱导,及sesn2启动子活化。2、在umuc3shjnk1和nonsense对照细胞中观察iso对细胞非贴壁克隆形成的影响:nonsense对照细胞中5μm和10μmiso处理能明显减少克隆形成;而在shjnk1转染细胞中,iso处理对细胞克隆形成没有明显影响。五、人膀胱癌组织中sesn2表达减弱,iso可调节小鼠癌组织sesn2表达增强1、在人膀胱癌组织样品中,癌组织与相邻的正常膀胱组织比较,sesn2表达下调明显甚至表达缺失。2、在bbn诱导的小鼠浸润性膀胱肿瘤模型中,iso+bbn组小鼠与bbn组小鼠相比,sesn2蛋白水平在小鼠膀胱组织中显著升高。结论1、亚致死剂量的ISO处理可诱导人肿瘤细胞系发生剂量依赖性自噬现象,且自噬与ISO引起的肿瘤细胞非贴壁克隆生长抑制有关。2、ISO诱导的自噬具有SESN2依赖性,ISO可增加SESN2 mRNA表达,同时增强SESN2的转录活性。3、ISO诱导的自噬需激活JNK/C-JUN通路,ISO通过调节转录因子C-JUN与SESN2启动子序列的AP-1结合位点结合,诱导SESN2转录激活,并进一步诱导自噬发生。4、与癌旁正常组织相比,SESN2在人癌组织中表达明显下调甚至表达缺失,而ISO可上调BBN诱导的小鼠膀胱癌组织SESN2表达。