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研究背景:心血管疾病的患病率与死亡率常年居高不下。目前人们对急性缺血性心脏病患者的救治主要采用缺血区域再灌注的方式,这是提高心肌梗死救治成功率的重要举措。但是,大量研究发现单纯再灌注疗法可加重已有的缺血性心肌损伤,甚至威胁患者生命,即心肌缺血/再灌注损伤（Myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI）。MI/RI的发生机制复杂,研究认为过量氧自由基生成、中性粒细胞浸润、线粒体结构与功能受损、心肌细胞坏死与凋亡等均参与其中,而且MI/R会引发炎症反应,影响缺血心肌的修复和转归。然而,目前对这种损伤尚无有效的缓解方法。细胞焦亡是一种程序性细胞死亡方式,表现为NLRP3炎性小体活化,caspase-1激活,细胞膜孔形成,炎症因子IL-1β和IL-18释放,从而放大炎症级联反应。研究报道,细胞焦亡参与了动脉粥样硬化、MI/RI等多种心血管疾病的发生发展,因此调控细胞焦亡是一种可能的心血管保护策略。已知热量限制（Caloric Restriction,CR）是一种抗衰老、抗肥胖、延迟或减少老龄相关疾病的饮食调控方法,并且对心血管系统具有多重保护作用,可防止血管发生动脉粥样硬化,提高心肌耐受性,延缓心脏衰老。本课题组前期实验发现CR可上调HIF-1α而调控心肌细胞自噬,但CR是否可通过调控细胞焦亡影响MI/RI尚无定论。因此本研究拟从细胞焦亡角度探讨CR对MI/RI的影响及相关机制。目的:1.确定热量限制是否可通过调控心肌细胞焦亡改善小鼠心肌缺血/再灌注损伤;2.探讨热量限制调控心肌细胞焦亡是否与抑制TLR4/NLRP3信号通路有关。方法:1.动物实验部分:（1）实验分组:将8月龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组:正常饮食+假手术组（AL+Sham）;正常饮食+心肌缺血/再灌注组（AL+I/R）;热量限制+假手术组（CR+Sham）;热量限制+心肌缺血/再灌注组（CR+I/R）;各组n=10。正常饮食组小鼠每日自由摄食,热量限制方法是开始给予正常食量的90%,之后每两周递减10%,共持续8周。心肌缺血/再灌注手术采用结扎冠脉左前降支的方法,缺血30min,再灌注24h;（2）热量限制期间监测小鼠体重变化,8周后采集终末体重值;（3）Even’s blue与TTC染色检测MI/R后心肌梗死面积;（4）HE染色确定心肌组织的病理损伤情况;（5）免疫组化法检测心肌组织中CD45的表达;（6）LDH、CK-MB、SOD及MDA含量测定反映心肌损伤情况;（7）Western blot法检测心肌组织中细胞焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1与TLR4的表达;（8）ELISA法检测IL-1β、IL-18含量。2.细胞实验部分:（1）实验分组:将H9c2心肌细胞分为以下5组:对照组（Control）;热量限制组（CR）;低氧/复氧组（H/R）;热量限制+低氧/复氧组（CR+H/R）;TLR4抑制剂TAK-242+低氧/复氧组（TAK-242+H/R）;（2）采用CCK-8法确定细胞存活率;（3）RT-PCR和Western blot法检测TLR4、NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1的表达;（4）免疫荧光法检测NLRP3、ASC的表达。结果:1.热量限制通过抑制细胞焦亡减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤1.1体重监测结果可见CR使小鼠体重减轻:实验期间,AL组小鼠体重呈稳中略增趋势,而CR组的体重略有降低;8周后CR组体重较AL组减轻（P<0.05）。1.2 Even’s blue与TTC染色结果显示,AL+I/R组心肌梗死面积增大,而CR+I/R组的心梗面积则较AL+I/R组减少了35%（P<0.01）,表明CR处理可减小小鼠的心肌梗死面积。1.3 HE染色结果显示:小鼠经I/R后心肌纤维出现断裂,间隙明显扩大;与AL+I/R组相比,CR+I/R组情况明显改善,偶有心肌纤维的断裂。说明CR处理能够减轻小鼠MI/R后心肌组织的病理损伤。1.4热量限制减少小鼠MI/R后心肌组织中CD45的表达:CD45免疫组化染色发现,与AL+Sham组相比,AL+I/R组的CD45阳性颗粒明显增多,CR处理后,CD45阳性颗粒有所减少,表明CR可减轻小鼠MI/R所致的炎症反应。1.5 CR可明显改善小鼠MI/R所致的心肌损伤:与AL+Sham组相比,AL+I/R组的LDH、CK-MB与MDA含量明显增加（P<0.01）,而SOD活性则降低（P<0.05）;与AL+I/R组相比,CR+I/R组LDH、CK-MB与MDA含量分别下降了17%、15%与21%,而SOD活性则增加了16%（P<0.05）。1.6 CR抑制MI/R后心肌组织细胞焦亡相关蛋白的表达:与AL+Sham组比较,AL+I/R组的NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1蛋白表达量显著上调（P<0.01）,而这些蛋白的表达量在CR+I/R组较AL+I/R组分别降低了32%、36%、26%、30%（P<0.05）。1.7 CR降低MI/R后血清中IL-1β、IL-18的含量:与AL+I/R组相比,CR+I/R组的血清IL-1β与IL-18含量分别减少了31%、33%（P<0.05）。1.8 CR抑制MI/R后心肌组织中TLR4的表达:与AL+Sham组相比,AL+I/R组的TLR4表达明显增加（P<0.01）,而CR+I/R组则较AL+I/R组减少了26%（P<0.05）。2.CR通过调控TLR4/NLRP3信号通路减轻H9c2心肌细胞低氧/复氧诱导的细胞焦亡2.1建立H9c2心肌细胞低氧/复氧模型及确定热量限制方案:CCK-8法检测结果显示,与Control组相比,低氧12h,复氧3h后细胞存活率明显降低（P<0.05）。用不同浓度的葡萄糖（1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、4.5g/L）对H9c2心肌细胞进行12h处理,发现用2g/L葡萄糖浓度处理12h可改善H9c2心肌细胞H/R后的存活率。故采用低氧12h/复氧3h,2g/L葡萄糖浓度处理12h模拟热量限制作为后续实验条件。2.2 CR可减少H9c2心肌细胞H/R后细胞焦亡相关蛋白的m RNA表达:RT-PCR结果显示,与Control组比较,H/R组的NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达水平显著升高（P<0.01）,CR+H/R组的NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18的m RNA表达量则较H/R组分别减少了33%、42%、34%、39%、28%和27%（P<0.05）。2.3 CR可抑制H9c2心肌细胞H/R后细胞焦亡相关蛋白的表达:Western blot检测结果显示,H/R组的NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1蛋白表达量显著上调（P<0.05）,而这些蛋白的表达量在CR+H/R组较H/R组分别降低了27%,39%,21%和33%（P<0.05）。2.4 CR可降低H/R诱导的H9c2心肌细胞中TLR4的表达:与Control组比较,H/R组的TLR4蛋白和m RNA表达量明显增加（P<0.01）,进行CR处理后,TLR4蛋白和m RNA表达水平分别降低了30%、31%（P<0.05）。2.5 TLR4抑制剂可降低细胞焦亡相关蛋白的m RNA表达:RT-PCR结果显示,H/R组的TLR4、NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1的m RNA表达量较Control组明显增加（P<0.01）,细胞经TAK-242处理后,TLR4和细胞焦亡指标NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1的m RNA表达水平降低（P<0.05）,这些作用与CR处理的效应类似（P<0.05）。2.6 TLR4抑制剂可减轻H/R诱导的H9c2心肌细胞焦亡:与Control组比较,H/R组的TLR4、NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1蛋白表达水平显著增加,CR处理后,这些蛋白的表达水平降低（P<0.05）,与H/R组相比,TAK-242+H/R组的TLR4、NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1的蛋白表达量也降低（P<0.01）,这与CR处理后的效果类似。同时,采用IF法进行细胞染色,NLRP3发红色荧光,ASC发绿色荧光,可见H/R组的NLRP3与ASC表达量均较Control组明显增加,而CR+H/R组和TAK-242+H/R组的NLRP3与ASC表达量则较H/R组减少,但CR+H/R组与TAK-242+H/R组之间比较无统计学差异。结论:1.热量限制可使小鼠术后心肌梗死面积减小,减轻心肌损伤标志物LDH、CKMB的释放以及心肌组织的氧化应激水平,同时缓解MI/R病理损伤程度,改善心肌缺血/再灌注损伤;2.热量限制可通过抑制NLRP3介导的细胞焦亡减轻心肌缺血/再灌注损伤,TLR4/NLRP3信号通路可能参与其中。