目的:神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是小儿最常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,早期转移多,是NB患者的主要死因;此高度的侵袭转移特性也成为NB在整个恶性肿瘤疾病中极具特点的现象。因此,探明NB的转移机制、控制转移是决定预后的关键,也是NB治疗所面临的最具挑战性的问题。目前临床上对恶性程度高、发生转移早的高危NB病人常采用超大剂量联合化疗,尽管开始时对治疗有效,但化学合成药物毒副作用大,易复发,效果不佳,而天然产物毒副作用相对较小,且具有靶向杀伤肿瘤细胞的优点,已成为目前抗肿瘤药物的研究热点。因此从中寻找抗NB转移的天然药物具有重要意义。本课题组已对吲哚2,3-二酮研究多年,1999年首次在国际会议上报告了吲哚2,3-二酮具有抗氧自由基的作用,不但能够保护正常神经细胞,而且可以拮抗环境毒素所造成的神经细胞的死亡,之后发现其还有抗肿瘤作用。吲哚2,3-二酮的这种既可以抗肿瘤又能抗氧自由基而保护正常细胞的优点,是目前大多数抗肿瘤药所不具备的重要特征。吲哚2,3-二酮的优势在于其分子量小,可口服给药,能够靶向抑制肿瘤细胞增殖,避免损伤正常细胞,且毒副作用低,是具有开发价值的天然小分子化合物类药物。本项目拟利用NB转移瘤细胞系和可视化动物模型明确吲哚2,3-二酮抗NB转移的作用,并探讨其分子机制。本研究旨在阐明吲哚2,3-二酮抗NB转移的作用及分子机制,以期发现NB转移治疗的潜在靶点。方法:1.体外培养人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,采用CCK8法检测不同浓度吲哚2,3-二酮对NB细胞的增殖活力的影响;采用软琼脂集落形成实验检测吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞集落形成能力的影响;用划痕实验检测不同浓度吲哚2,3-二酮(0、50、100、200μmol/L)处理后,SH-SY5Y细胞迁移能力的变化;用Transwell小室法检测不同浓度吲哚2,3-二酮(0、50、100、200μmol/L)处理后,SH-SY5Y细胞侵袭和运动能力的改变;用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测不同浓度吲哚2,3-二酮处理后对SH-SY5Y细胞凋亡、细胞周期、线粒体膜电位的影响情况;采用荧光染色、RT-PCR、Westernblot等方法,观察不同浓度吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响,并探讨其相关作用机制。2.采用免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)检测45例神经母细胞瘤患者癌组织中LSD1的表达情况。3.将慢病毒载体pLenti-LUC与辅助质粒共同转染293 T细胞,制备好慢病毒,用此慢病毒感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,继续经嘌呤霉素筛选出持续表达较强发光信号的细胞,然后体外扩大培养,将荧光素酶标记的SH-SY5Y细胞注射于裸鼠左心室制备神经母细胞瘤转移瘤模型。活体成像仪监测裸鼠在体荧光信号。观察吲哚2,3-二酮对裸鼠转移瘤模型生长的抑制情况,检测吲哚2,3-二酮处理后裸鼠体内各主要脏器的转移情况,并观察肺、脑转移灶的病理学变化。结果:1.体外培养人NB细胞系SH-SY5Y,吲哚2,3-二酮(0、50、100、200μmol/L)处理SH-SY5Y细胞48 h后,分别检测了吲哚2,3-二酮对细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期的影响。用CCK8试剂盒检测细胞增殖结果显示,吲哚2,3-二酮能明显抑制SH-SY5Y的细胞增殖;软琼脂集落形成实验中,吲哚2,3-二酮处理后的细胞,在软琼脂中继续生长14天后,拍照观察SH-SY5Y细胞集落形成数,结果发现吲哚2,3-二酮作用后能明显减少SH-SY5Y细胞的集落形成数,进一步证实了吲哚2,3-二酮抑制细胞增殖的作用;划痕实验结果显示,与对照组比较,吲哚2,3-二酮处理组细胞的迁移能力减弱(P<0.05),并且呈浓度依赖性;Transwell小室实验结果发现,与对照组比较,细胞侵袭运动能力下降(P<0.01),结果也呈明显的浓度依赖性;在荧光显微镜下观察到200μmol/L吲哚2,3-二酮处理组细胞出现典型的凋亡形态学变化:如细胞核固缩、核分裂现象明显,凋亡小体数目增多;采用流式细胞术(FCM),用FITC-Annexin V/PI双染的方法,检测到吲哚2,3-二酮处理后,随着用药浓度的增加,SH-SY5Y细胞的凋亡率随之上升;进一步采用FCM法检测细胞周期,分析结果表明,经50、100、200μmol/L吲哚2,3-二酮处理48 h后,G1期SH-SY5Y细胞数明显增加,呈明显的G1期阻滞;不同浓度吲哚2,3-二酮处理NB细胞48 h后,用罗丹明123染色,采用FCM检测了线粒体膜电位的变化,结果显示,加药后线粒体膜电位明显下降,并呈浓度依赖趋势。2.通过实时定量(Real-time)PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)、免疫荧光、免疫共沉淀等方法,检测了吲哚2,3-二酮处理SH-SY5Y细胞后,相关信号通路的变化,结果显示,吲哚2,3-二酮能够产生抑制NB细胞增殖、迁移、侵袭的能力,可能一方面是通过降低线粒体膜电位,从而诱导细胞凋亡,另一方面,吲哚2,3-二酮又可作用于线粒体外膜上的单胺氧化酶MAO,通过抑制细胞转移相关的活性氧(ROS),缺氧诱导因子(HIF-1α)、趋化因子受体(CXCR4)、基质金属蛋白酶(MMP2、MMP9)、血管内皮生长因子(VEGF)等发挥作用,从而在抑制肿瘤细胞的生存、增殖、血管生成、侵袭和转移等多个方面发挥抗NB细胞转移的能力。而且,可能由于吲哚2,3-二酮分子量小,能够直接入核抑制单胺氧化酶赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶(LSD1)的活性,从而改变了LSD1对组蛋白H3的赖氨酸k4位点的甲基化修饰,使H3K4的单、双甲基化水平增高,进而改变了基因表达调控。同时,吲哚2,3-二酮通过抑制LSD1的表达,使p53基因表达上调,进一步激活其下游基因p21蛋白,p21蛋白与细胞周期素依赖性激酶复合物结合,抑制其活性,使细胞有丝分裂停滞在G1期;另一方面,p53还可以通过上调Bax表达以及下调Bcl-2、MDM2表达,促进癌细胞凋亡。此外,由于吲哚2,3-二酮抑制了LSD1的活性,从而减少了P-NF-κb与LSD1的结合,进而抑制了ERK的活性,也影响了TGFβ1对ERK的激活,吲哚2,3-二酮通过抑制TGFβl的表达,从而抑制了肿瘤侵袭转移的上皮间质转化EMT过程。因此,我们推断吲哚2,3-二酮可能是通过多途径产生抗神经母瘤细胞转移的作用。3.免疫组织化学法检测45例神经母细胞瘤患者癌组织中LSD1的表达情况,其中阳性表达44例,阴性表达1例,其阳性表达率97.78%,提示在NB患者肿瘤组织中LSD1高表达。4.裸鼠神经母细胞瘤转移瘤模型采用荧光素酶Luc标记的SH-SY5Y细胞,经左心室注射肿瘤细胞的方法造模。将成功建模的入选裸鼠随机分为模型组、阳性药物环磷酰胺(CTX 40 mg/kg)组、吲哚2,3-二酮治疗组(吲哚2,3-二酮200 mg/kg)、阳性药物CTX和吲哚2,3-二酮合用组(CTX 20 mg/kg+吲哚2,3-二酮200 mg/kg),用小动物活体成像仪每周进行活体成像,观察裸鼠转移灶的形成与药物治疗情况,第4周活体成像后结束实验,结果发现,与模型组相比,吲哚2,3-二酮治疗组、阳性药物CTX组、以及吲哚2,3-二酮和CTX合用组裸鼠体重变化差异无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,各用药组均能减少裸鼠体内转移灶荧光强度,差异有统计学意义(P<0.01);各用药组均能减少裸鼠骨组织转移灶离体成像的荧光信号强度,差异有统计学意义(P<0.01);各用药组均能减少裸鼠体内主要脏器转移灶离体成像的荧光信号强度,差异有统计学意义(P<0.01)。对各组裸鼠血清中肿瘤转移相关因子VEGF、MMP2、MMP9的检测结果显示,模型组各因子含量较其他三组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),其中VEGF浓度,与模型组比较,ISA组和CTX+ISA合用组含量更低,差异有统计学意义(P<0.05);MMP2、MMP9浓度,与模型组比较,其他各组含量更低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。对各组裸鼠血清中氧化应激相关指标SOD(超氧化物歧化酶)、GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)、MDA(丙二醛)的检测结果显示,CTX组SOD、GSH-PX活力显著低于其他三组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),与CTX组比较,ISA组、CTX+ISA合用组裸鼠血清SOD含量更高,差异有统计学意义(P<0.01),CTX+ISA合用组裸鼠血清GSH-PX含量更高,与其他三组比较,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);而CTX组MDA浓度显著高于模型组与CTX+ISA合用组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。对各组裸鼠血清中肾功能相关指标的检测结果显示,CTX组肌酐、尿素氮含量较其他三组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。对各组裸鼠血清中肝功能相关指标的检测结果显示,CTX组碱性磷酸酶(AKP)、谷氨酰转移酶(GGT、γ-GT)、谷丙转氨酶(ALT)、血清总胆红素(Tbil)含量较模型组与CTX+ISA合用组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),CTX组谷草转氨酶(AST)较模型组含量更高,差异有统计学意义(P<0.05),其他各组间差异无统计学意义。ALT/AST的比值,各组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。对各组裸鼠血清中钙、钾、钠电解质相关指标的检测结果显示,各组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:1.吲哚2,3-二酮具有抑制SH-SY5Y细胞增殖、迁移和侵袭能力的作用,能够明显诱导细胞凋亡并造成细胞周期G l期阻滞;2.细胞水平分子机制实验结果显示,吲哚2,3-二酮可能是通过多途径产生抗神经母瘤细胞转移的作用,一是可能通过MAOA/HIF/CXCR4信号通路,并且抑制VEGFR1活化,降低ROS水平,抑制肿瘤血管生成;二是可能通过LSD1/p53介导的细胞凋亡通路,增加p53的表达,促进细胞凋亡;3.体内实验中,采用心腔注射瘤细胞的方法成功制备了Luc标记的SH-SY5Y裸鼠转移瘤模型;吲哚2,3-二酮能够减少裸鼠体内NB细胞的转移,与化疗药环磷酰胺合用可以增强环磷酰胺的抗肿瘤转移效果,并能减少环磷酰胺对肝、肾造成损伤的毒副作用,产生增效减毒的作用。