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【研究背景】肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌,约占肝癌病例总数的70%,是一种严重危害人体身体健康的癌症之一。肝癌的治疗方法有很多种,比如手术切除、肝移植、经导管动脉化疗栓塞治疗和系统化疗等。手术切除和肝移植是潜在的治疗方法,但由于大多数患者发现时已经是癌症晚期,只有少数的患者能够接受这类治疗。系统化疗在临床上较常见,但是晚期肝细胞癌患者通常有其他的肝脏疾病,患者具有较差的全身化疗耐受性,以及化疗毒副作用大,使治疗效果不满意。中药具有悠久的历史,目前中药已经广泛用于治疗癌症。华蟾素是一种常见的中药,其是从蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑框蟾蜍的皮肤的分泌物中提取的中药。华蟾素的主要成分为蟾毒内脂类、生物碱类、多肽类和胆固醇类,具有清热解毒、消炎止痛、增强免疫力的作用。许多研究表明,华蟾素具有抗肿瘤活性和增强化疗的作用,且毒性低、使用安全、不良反应少、抗癌谱广和无成瘾性等优点。华蟾素对非小细胞肺癌、结直肠癌、胃癌、食管癌等多种肿瘤均具有抗肿瘤作用。目前,华蟾素注射液、华蟾素胶囊、华蟾素口服液等均为华蟾素在临床上应用的剂型,在抗肿瘤方面有较好的疗效。在本研究中,我们将会探究华蟾素对肝癌细胞的凋亡作用,并对华蟾素诱导肝癌细胞凋亡的机制进行进一步的研究,其结果可以为华蟾素的临床应用提供更加有效的理论依据。【研究目的】本课题以肝癌细胞为研究对象,通过研究华蟾素对肝癌细胞的细胞活力的影响,并通过体内实验加以验证。再进一步研究华蟾素对肝癌细胞线粒体功能的影响,初步探讨华蟾素通过线粒体途径诱导肝癌细胞凋亡的机制。【研究方法】1、通过MTT实验和LDH实验研究华蟾素对肝癌细胞生存的影响,通过细胞划痕实验研究华蟾素对肝癌细胞迁移能力的影响,通过克隆形成实验和EDU实验研究华蟾素对肝癌细胞的增殖抑制作用,通过DAPI染色、流式细胞术和TUNEL实验研究华蟾素对肝癌细胞的凋亡作用。2、通过肿瘤异种移植和免疫组化实验验证华蟾素在体内环境下对肝癌细胞的抑制作用。3、通过检测线粒体膜电位、ATP含量和Western blot、RT-q PCR方法检测线粒体途径细胞凋亡的相关分子表达的变化,研究华蟾素对肝癌细胞线粒体功能的影响。【研究结果】1、MTT实验、镜下观察实验和LDH实验的结果提示华蟾素对肝癌细胞的活力具有抑制作用;克隆形成实验和EDU实验的结果提示华蟾素能抑制肝癌细胞的增殖;细胞划痕实验的结果提示华蟾素对肝癌细胞的迁移能力具有抑制作用;DAPI染色实验、流式细胞术和TUNEL实验的结果提示华蟾素能促进肝癌细胞的凋亡作用。2、裸鼠皮下成瘤和免疫组化实验的结果提示华蟾素能够显著抑制肝癌细胞在裸鼠体内的成瘤及增殖。3、通过检测肝癌细胞内线粒体膜电位和ATP生成含量的实验显示华蟾素能够显著降低线粒体膜电位,抑制肝癌细胞ATP的生成。RT-q PCR实验和Western Blot的结果提示华蟾素会诱导肝癌细胞内凋亡相关分子Bax的表达上调,Bcl-2的表达下调,p65的磷酸化水平显著减少,而p65总水平无明显变化。【研究结论】我们的结果表明,华蟾素可以抑制肝癌细胞SNU-739的增殖,并且通过线粒体途径诱导肝癌细胞的凋亡。