肝脏是一个独特的免疫器官,它含有大量的天然免疫细胞和获得性免疫细胞,并能诱发多种复杂而又精细的免疫反应。肝脏同时也是一个病毒易感性器官,肝脏免疫系统与嗜肝性病毒之间的角逐往往会产生截然不同的结果,比如免疫排斥和免疫耐受。对肝脏抗病毒免疫应答调节机制的研究具有重要的意义,它能加深人们对肝脏免疫学的理解,为病毒相关的肝脏疾病的预防和治疗提供理论依据。研究表明,多种因素的综合作用导致了如此迥异的肝脏抗病毒免疫应答反应,比如共生菌、病毒特性、外周预存免疫等等。肝脏持续接受来自门静脉的肠道回流血,为了保护自身不会因共生菌代谢组分的过度活化而诱导损伤,肝脏免疫系统会表现出免疫耐受的特性。经典的观点认为共生菌维持了肝脏独特的免疫微环境,此微环境会驯化多种肝脏免疫细胞使其具有免疫负调的特性。然而最新的研究表明共生菌还具有更广泛的促进免疫应答的作用,比如诱生淋巴组织、维持粘膜免疫稳态、促进多种细胞亚群的发育分化等。尽管如此,共生菌在肝脏抗病毒免疫应答中的作用依然是未知的。不同病毒入侵肝脏会诱发不同的免疫反应进程。比如甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus, HAV)和腺病毒通常诱导肝脏发生急性的免疫排斥反应,而乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)则通常会诱导肝脏免疫耐受而形成慢性携带。这说明病毒本身具有调节肝脏抗病毒免疫反应的能力,比如HBV慢性感染会诱导自然杀伤细胞(Natural Killer cell, NK cell)的活化程度和杀伤功能降低。这是一个很有趣的话题,对其机制的研究将有助于我们理解病毒调控肝脏免疫的机制,也有可能会为临床治疗带来新的靶标。当外周免疫系统含有病毒特异性的记忆细胞时,机体能够很好的清除入侵肝脏的病毒。利用这一特性,部分肝脏病毒疫苗取得了成功。但是,仍旧有部分免疫功能低下的人群无法形成有效的疫苗应答反应,所以新型免疫佐剂和免疫方案的建立就显得尤为重要。本文主要从以上三个角度对肝脏抗病毒免疫的调节机制进行研究,并取得了以下结果。Ⅰ、共生菌促进肝脏丫6T-17抗病毒免疫应答本研究采用对5-6周龄C57BL/6小鼠饲喂抗生素的方法清除其共生菌群,以嗜肝性腺病毒感染为模型检测其抗病毒免疫变化,并确定起主要作用的细胞和细胞因子,最后又进一步探究了共生菌对此细胞作用的机制。实验中采用流式细胞术(FACS)分析淋巴细胞表型、活化状态及细胞因子分泌,采用定量PCR(Real-time PCR)检测病毒和免疫分子的基因表达,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清中细胞因子的表达,采用冰冻切片观察病毒荧光蛋白表达,采用细胞清除研究特定细胞群体的功能,采用外源细胞因子和刺激剂注射研究其抗病毒功能及作用机制。本研究通过上述方案取得了以下结果：1.共生菌缺失小鼠腺病毒易感性增加共生菌小鼠外周疫苗免疫应答正常,但是感染腺病毒后发现其肝脏病毒基因和病毒蛋白的表达明显高于正常小鼠,说明共生菌缺失导致肝脏腺病毒易感性增加。2.γδT细胞分泌IL-17降低导致共生菌缺失小鼠抗腺病毒能力降低辐射清除小鼠免疫系统后,共生菌群缺失小鼠腺病毒易感性不再增加,表明其病毒易感性与免疫系统相关；共生菌缺失小鼠NK细胞比例和活化不受影响,PK136抗体清除NK/NKT细胞不影响共生菌缺失小鼠肝损伤,说明NK细胞在此模型中不起作用；腺病毒感染5天后共生菌缺失小鼠CTL比例和活化程度低于野生型小鼠；共生菌缺失小鼠肝脏γδT细胞分泌IL-17显著降低,并且其肝脏单个核细胞培养上清中IL-17蛋白和肝脏组织中的IL-17mRNA的表达也降低；而且外源IL-17可以恢复共生菌群缺失小鼠抗病毒能力。3.共生菌诱导成年小鼠肝脏富集γδT-17细胞FACS检测成年小鼠各脏器γδT细胞分泌IL-17的能力,发现其从强到弱顺序如下：肝脏>腹腔>肺脏>脾脏>胸腺>小肠内皮；与其他高表达γδT-17的脏器不同,肝脏γδT细胞表达IL-1R较低,暗示其维持可能不依赖于IL-1信号；成年小鼠肝脏γδT-17细胞及相关分子的表达高于幼龄小鼠,说明成年小鼠肝脏后天富集γδT-17细胞。4.共生菌缺失小鼠γδT-17细胞减少与IL-7和IL-1信号无关给予共生菌缺失小鼠外源IL-7并不能恢复其肝脏γδT细胞分泌IL-17能力；虽然共生菌缺失小鼠Kupffer细胞的IL-1p分泌有所下调,但是体内清除Kupffer细胞后肝脏γδT-17细胞不但没有降低反而有所上调；这些结果说明共生菌不通过经典的IL-7和IL-1信号促进肝脏γδT-17细胞。5.共生菌来源的多种TLR刺激剂促进肝脏γδT细胞分泌IL-17给共生菌缺失小鼠单种TLR刺激剂或Curdlan均不能恢复其肝脏γδT细胞分泌IL-17,但是同时给予TLR2、TLR4和TLR9刺激剂则会显著恢复其IL-17的分泌能力,而且TLR2/4/9三缺陷小鼠γδT-17细胞不受共生菌影响；对应的,单种抗生素处理不能导致小鼠肝脏γδT-17下调,但是任意两种抗生素联合使用均可达到下调肝脏γδT-17的效果。综上,本研究发现共生菌通过促进肝脏γδT细胞分泌IL-17而增强肝脏的抗腺病毒能力。共生菌通过多种TLR信号的联合作用维持肝脏γδT-17细胞,而且此过程不依赖于IL-1和IL-7信号途径。本研究首次发现共生菌可促进肝脏抗病毒免疫应答,并对其中的机制进行了解析,对临床的诊断治疗有一定指导意义。Ⅱ、HBV相关的NK细胞高表达抑制性受体NKG2A的机制本研究采用对5-6周龄C57BL/6小鼠高压注射pAAV/HBV1.2质粒的方法构建HBV携带小鼠以模拟人类HBV慢性感染患者,然后检测其NK细胞表型、功能的变化并对其中的机制进行探究。实验中采用FACS分析淋巴细胞表型及细胞因子分泌,采用细胞转输研究特定细胞群体对NK细胞的调节功能,采用抗体阻断研究特定信号对NK细胞抗病毒功能的影响,采用BrdU掺入法检测淋巴细胞体内增殖,采用细胞体外刺激或共培养检测特定因子对NK细胞表型功能的影响。本研究通过上述方案取得了以下结果：1.HBV携带小鼠NK细胞NKG2A表达增加HBV携带小鼠NK细胞,特别是肝脏NK细胞表面NKG2A表达显著提高,肝脏NKG2A+NK细朐高表达CXCR6可能是其肝脏趋向性的原因之一；HBV携带小鼠自发转阴后其NK细胞NKG2A表达也随之降低,说明NKG2A表达和病毒载量正相关。2. NKG2A抑制HBV携带小鼠NK细胞的抗病毒功能对HBV携带的Rag1-/-小鼠体内注射NKG2A阻断抗体后,其血清HBsAg含量持续降低,而注射同型抗体组则没有如此变化,此结果说明体内阻断NKG2A能够恢复HBV携带小鼠NK细胞的抗病毒能力。3.HBV小鼠CD4+调节性T细胞通过分泌IL-10上调NK细胞NKG2A表达HBV携带小鼠肝脏NKG2A+NK细胞而非NKG2A-NK细胞比对照小鼠摄入更多的BrdU,这说明NKG2A+NK细胞在HBV携带小鼠体内被诱导扩增；体外培养和体内转输实验发现HBV携带小鼠CD4+调节性T细胞能够促进NK细胞上调表达NKG2A,而且此过程依赖于其上调分泌的IL-10；体外诱导实验表明重组人IL-10也可以直接诱导人NK细胞上调表达NKG2A。综上,本研究发现慢性HBV感染会上调肝脏CD4+调节性T细胞分泌IL-10,后者可以直接诱导NK细胞高表达NKG2A从而使肝脏NK细胞抗病毒活性下调,而阻断NKG2A信号可以显著增强NK细胞介导的抗HBV反应。本研究揭示了慢性HBV感染中NK细胞耐受的机制,为乙肝患者的治疗提供了新的靶标。Ⅲ、IL-12促进HBsAg疫苗免疫应答本研究以IL-12为共佐剂对成年C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠进行HBsAg疫苗免疫,并衡量不同IL-12给药方案下的促HBsAg疫苗的效果。实验中采用放射免疫的方法检测小鼠血清HBV相关指标,采用ELISA检测HBsAg特异性抗体亚型,采用ELISPOT检测HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞,采用高压注射pAAV/HBV1.2质粒的方法模拟HBV感染。本研究通过上述方案取得了以下结果：1.确立IL-12和Alum作为HBsAg疫苗联合佐剂的方案传统Alum佐剂比IL-12能诱导更高的anti-HBs产生,而IL-12则比Alum能更好的促进IgG2a型抗体产生,同时使用IL-12和Alum作为HBsAg疫苗共佐剂可以同时获取两者的优点。2.IL-12作为联合佐剂方案的优化IL-12与HBsAg疫苗混合注射而非分开单独注射可有效诱导Thl型极化反应；IL-12的促进作用仅在初次免疫中体现,二次或者三次免疫中重复使用IL-12不能增强其Thl型极化反应；IL-12促进HBsAg疫苗反应具有剂量依赖性。3.IL-12联合HBsAg疫苗免疫小鼠具有更强的抗病毒能力与常规HBsAg疫苗免疫小鼠相比,IL-12联合免疫小鼠在HBV感染后可以更快速的产生高浓度anti-HBs,并更加迅速的降低HBsAg和HBeAg表达,表明其具有更强的抗病毒能力。综上,IL-12作为HBsAg疫苗的新型佐剂可以通过诱发Thl型反应增强机体抗HBV能能力,IL-12最佳的给药方式是在初次免疫中与疫苗混合使用,而且其促进作用具有剂量依赖性。此研究对临床疫苗佐剂的开发和利用有一定的指导意义。