【摘 要】
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目的:明确GATA6在人口腔鳞状细胞癌细胞增殖中的作用,初步研究探讨沉默GATA6后对人口腔鳞状细胞癌细胞中NF-κB信号通路的影响,探索其之间可能的相互作用机制。方法:1.细胞培养、传代:取出封存于液氮中的人口腔鳞癌细胞株CAL-27、SCC-4,人正常上皮细胞株HOK细胞,复苏后将细胞悬液吸入含适量培养基的细胞皿中进行细胞培养并完成常规传代。2.采用实时荧光定量RT-PCR方法检测人口腔鳞癌细
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目的:明确GATA6在人口腔鳞状细胞癌细胞增殖中的作用,初步研究探讨沉默GATA6后对人口腔鳞状细胞癌细胞中NF-κB信号通路的影响,探索其之间可能的相互作用机制。方法:1.细胞培养、传代:取出封存于液氮中的人口腔鳞癌细胞株CAL-27、SCC-4,人正常上皮细胞株HOK细胞,复苏后将细胞悬液吸入含适量培养基的细胞皿中进行细胞培养并完成常规传代。2.采用实时荧光定量RT-PCR方法检测人口腔鳞癌细胞以及正常口腔上皮细胞中GATA6的m RNA表达量。3.蛋白质印迹法Western blot检测人口腔鳞癌细胞以及正常上皮细胞中GATA6的蛋白表达量。4.设计合成3条GATA6基因的干扰片段（siRNA for GATA6）转染至GATA6表达上调最高的人口腔鳞癌细胞株SCC-4和对照细胞系。RT-PCR和Western blot方法验证GATA6基因沉默效率。5.CCK8法观察转染后各实验组细胞增殖变化情况。6.PI单染检测细胞周期。7.蛋白质印迹实验Western blot检测转染后各组细胞中NF-κB信号通路关键蛋白（IκB、p-IκB-α、IKKα、IKKβ、p-IKKα/β、NF-κB p65、p-NF-κB p65）表达情况。结果:1.人口腔鳞癌细胞以及口腔正常上皮细胞中GATA6 m RNA和蛋白表达量的变化:与其在HOK细胞中的表达相比,CAL-27、SCC-4细胞GATA6 m RNA表达量显著有所上调。同样与HOK细胞相比,SCC-4细胞GATA6基因蛋白表达量有显著增加,而CAL-27细胞GATA6基因蛋白表达水平与HOK细胞相比无显著变化。2.将GATA6 siRNA转染至表达上调最显著的SCC-4细胞,RT-PCR和Western blot分别测定表达下调效果:转染了干扰片段三个实验组中GATA6siRNA-2、GATA6siRNA-3组较纯细胞空白对照组GATA6 m RNA表达明显下降。而GATA6siRNA-1组较纯细胞空白对照组GATA6 m RNA表达变化不显著,干扰效率未能到达50%,认为细胞干扰并不成功。以β-actin作为内参抗体,分别测量了各组转染后SCC-4细胞内GATA6的蛋白表达水平。其中在干扰成功的实验组GATA6siRNA-2、GATA6siRNA-3中SCC-4细胞内GATA6的蛋白表达水平较纯细胞空白对照组明显降低。3.通过CCK8法检测各组细胞增殖情况（连续检测7天）发现:在各时间段内,有效干扰实验组细胞的吸光度值与空白对照组和无效干扰组GATA6siRNA-1相比均减低,细胞增殖缓慢,生长水平受到明显地抑制,在细胞转染后的第7天,对各组细胞生长增殖的抑制作用最大。提示靶向沉默GATA6的表达潜在具有抑制口腔鳞癌细胞增殖的重要作用。4.PI单染检测各组细胞周期发现:有效干扰实验组GATA6siRNA-2组和GATA6siRNA-3组G0/G1期细胞比例较SCC-4纯细胞空白对照组和无效干扰组GATA6siRNA-1上调明显。细胞在S期与G2/M期的比例明显减少。通过干扰GATA6表达,G0/G1细胞周期受到明显阻滞,进而细胞增殖能力也因此受到了抑制。5.应用Western blot方法检测转染后各组细胞中NF-κB信号通路关键蛋白（IκB、p-IκB-α、IKKα、IKKβ、p-IKKα/β、NF-κB p65、p-NF-κB p65）发现:有效干扰实验组GATA6siRNA-2组和GATA6siRNA-3组较空白对照组和无效干扰组GATA6siRNA-1组NF-κB信号通路关键蛋白p-IκB-α、IKKα、IKKβ的表达量显著下降,进而在一定程度上抑制NF-κB信号通路的活化。结论:GATA6在口腔鳞癌细胞系SCC-4细胞中高表达,通过siRNA干扰SCC-4中的GATA6使其沉默,可以抑制口腔鳞癌细胞的生长增殖,阻滞其细胞周期,同时对NF-κB信号通路激活起到了抑制作用。
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