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胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是最致命的脑部肿瘤,5年死亡率超过90%。GBM致死率高,这是由于其在治疗上存在各方面的局限性,比如平均发病年龄高、肿瘤的位置、以及目前对肿瘤的病理生理学认识仍不足等。目前治疗GBM常用方法为手术切除、放疗和化疗。在GBM中,表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）表达非常普遍,以 EGFR 过表达为特征的肿瘤患者,一般存活率较低。当检测到EGFR扩增后,与EGFR过表达和其他GBM临床特征相关的基因特征已经能够确定。EGFRvⅢ（Epidermal growth factor receptor variant Ⅲ）突变是GBM中EGFR突变最常见的一种类型,EGFR过表达和EGFRvⅢ突变均能增强胶质母细胞瘤的致瘤性。EGFRvⅢ能够自磷酸化,因为其具有不受配体依赖性酪氨酸激酶活性。研究表明,EGFRvⅢ还能够增强肿瘤细胞的DNA修复能力,从而使肿瘤治疗产生放疗抗性。适配体是由指数富集配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）筛选获得的单链核苷酸,它能够与靶标高特异性结合,但存在难以通过生物屏障等缺点。外泌体是由完整的膜结构构成的细胞外囊泡,具有很好的生物相容性,是天然的药物递送载体,但不具有靶向性。通过将外泌体与适配体结合,可以结合两者的优点而互补两者的缺陷,从而能够实现特异性靶向并有效治疗胶质瘤的目的。在本课题中,我们首先使用来自C57BL/6背景的小鼠提取间充质干细胞,通过原代分离培养并传代纯化后,对细胞进行形态学上的观察,并且将P2代后的细胞与 CD29、Sca-1、CD105、CD44、CD11b、CD34、CD45、CD31、Ia、CD86等流式抗体孵育,用流式细胞分析术鉴定所提取的间充质干细胞的免疫表型和纯度。在培养得到间充质干细胞后,我们采用差速离心联合膜亲和法来提取细胞上清中的外泌体,并且通过结合电镜观察、纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径和western blot法检测蛋白标志物这三种方式来鉴定所提取的外泌体样本。在得到间充质干细胞来源的外泌体后,我们利用胆固醇与膜具有高度亲和性的原理,将靶向U87-EGFRvⅢ细胞的适配体U2的5’端修饰上胆固醇基团,并在胆固醇与U2之间辅以中间linker,将此修饰适配体U2与所提取的天然外泌体经过室温震荡共孵育一定时间后,获得外泌体-适配体复合物（Exo-U2）,随后我们对Exo-U2进行体外抑瘤、放射敏感性和穿透血脑屏障等实验。首先我们将绿色荧光染料PKH67标记的且带Cy5红色荧光的Exo-U2与人脑胶质瘤细胞株U87-EGFRvⅢ共孵育,在共聚焦显微镜下观察细胞摄取Exo-U2的情况。随后我们利用CCK-8法和EdU法探究Exo-U2对U87-EGFRvⅢ细胞增殖能力的影响,利用transwell迁移实验探究Exo-U2对U87-EGFRvⅢ细胞迁移能力的影响,利用western blot的方法探究Exo-U2对U87-EGFRvⅢ细胞的增殖和迁移产生抑制作用的分子机制,利用克隆形成实验探究Exo-U2联合X-Ray照射对U87-EGFRvⅢ 细胞的影响,利用 western blot 探究 Exo-U2 对 U87-EGFRvⅢ 细胞产生放射增敏作用的分子机制。此外,在动物水平上,我们给C57BL/6小鼠尾静脉注射带Cy5荧光的Exo-U2,通过活体成像观察Exo-U2在小鼠体内的分布情况。实验结果:通过在倒置显微镜下观察所分离提取的小鼠骨实质来源间充质干细胞和利用流式细胞仪进行免疫表型鉴定,显示该细胞为形态一致的贴壁生长的成纤维样细胞,并且阳性高表达间充质细胞表面抗原CD29、CD44、CD105,干细胞标志物Sca-1,阴性低表达造血细胞标志CD34、白细胞表面标志CD45、巨噬细胞和单核细胞表面标志CD11b、内皮细胞表面标志CD31、主要组织相容性复合体Ia和CD86;通过电镜观察形貌、纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）技术检测粒径和western blot检测蛋白标志物后,得出所提取的为具有完整膜结构的囊泡样结构、粒径在120 nm左右并且表达CD63、CD81、TSG101的外泌体;利用倒置激光共聚焦显微镜,观察到细胞内不仅含有大量带绿色荧光的外泌体,还含有大量的既带绿色荧光又有红色荧光的Exo-U2;CCK-8和EdU实验显示Exo-U2能抑制U87-EGFRvⅢ细胞的增殖;transwell迁移实验显示Exo-U2能降低U87-EGFRvⅢ细胞的相对迁移率;westem blot结果显示Exo-U2能降低U87-EGFRvⅢ细胞的EGFRvⅢ磷酸化蛋白和AKT磷酸化蛋白的表达。上述结果提示Exo-U2具有体外抑瘤作用。克隆形成实验显示Exo-U2联合X-Ray照射能降低U87-EGFRvⅢ细胞的形成克隆数;western blot实验显示Exo-U2能降低U87-EGFRvⅢ细胞ATM磷酸化蛋白的表达;上述结果提示Exo-U2可增强胶质瘤的放射敏感性。活体成像显示Exo-U2可进入脑部,提示Exo-U2可以穿透血脑屏障。结果表明:（1）本实验已获得小鼠间充质干细胞来源的外泌体;（2）我们已将外泌体和适配体两者连接,形成的Exo-U2能被U87-EGFRvⅢ细胞所摄取;（3）Exo-U2具有体外抑瘤作用,能抑制U87-EGFRvⅢ细胞的增殖、迁移,其可能的机制是通过降低细胞EGFRvⅢ磷酸化蛋白的表达,进而影响下游的信号通路;（4）Exo-U2可增强胶质瘤的放射敏感性,可发展为胶质瘤的放射增敏剂。（5）Exo-U2能入脑,提示其可能有穿透血脑屏障的作用,为下一步的Exo-U2的体内治疗作用研究打下基础。