基于质谱的Bottom-up鉴定方法是目前应用最为广泛的蛋白质组学研究策略,它的主要流程是将复杂的蛋白质样品用酶消化成肽段,然后运用液相色谱分离,后续接串联质谱检测,对结果进行检索,根据获得的肽段谱图,与数据库进行匹配,检索蛋白质。这种研究方法面临着样本中蛋白质种类多、丰度分布动态范围极宽的挑战。目前为止,仍然没有一种分离方法能够在一个维度上分辨所有肽段组分。因此,在质谱分析前端,运用二维液相系统进行预分离,降低质谱进样前样本复杂程度,成为当前降低蛋白质组复杂性的重要策略。高pH反相分馏作为第一维离线色谱分离,与低pH反相液相联合成二维液相色谱分离,再与质谱相联用的方法,在复杂生物样本蛋白质组深度覆盖和差异分析研究中获得广泛应用。常规高效液相色谱采用线性连续梯度洗脱模式,具有较高分离效率,而且能灵活改变级联收集方案,但常规液相仍存在各种限制,如对初始样本的大量需求和复杂的合并过程,以及由此带来的肽段的吸附损失。针对以上问题,本文尝试建立基于超高效液(UPLC)和八端口转子阀的微升级预分离系统,在微量样本的情况下,实现对其蛋白质组的深度覆盖。本论文前言部分介绍了常见的二维液相分离方法,蛋白质组学研究背景以及定量蛋白质组学研究进展,提出了本文的研究目的和研究思路。首先,为了实现蛋白质组的深度覆盖,我们将超高效液相的高分辨率与八端口转子阀自动化的组分分馏相结合,在基于色谱柱的液相分离系统中,实现微克级初始样本的超高效自动化预分离。该体系具有多种优势,首先,与常规液相相比,UPLC可以实现更高分辨率的肽段色谱分离,同时产生较小的馏分体积,降低了大体积样本热干过程造成的样本损失;其次,用户可以根据实验需要,编程改变八端口转子阀的切换模式,从而实现可定制馏分合并方案,生成需要的馏分数量。使用人肝癌细胞系HepG2全蛋白酶切肽段来验证方法的分离效率及方法重复性,稳定性。结果表明,我们与传统StageTip方法相比,两维分离之间具备更好的互补性,肽段鉴定数提高了23.52%。并且重复试验间具有非常高的定量重现性(R~2>0.95)。该方法提供了一种灵活、简便、稳定的微量蛋白质组深度覆盖分析策略。我们以超高效液相和八端口转子阀建立的微升级预分离方法,结合TMT(Tandem Mass Tag)化学标记定量技术,研究靶向药物索拉非尼(Sorafenib)治疗肝细胞癌患者有效和无效病人的肝脏癌组织和癌旁组织蛋白质组的变化。共鉴定到蛋白6379个,有准确定量信息的蛋白有5642个,在癌组织样本中,发现显著性差异蛋白474个,相较于治疗无效病人,在治疗有效病人的癌组织中,表达量显著性升高的蛋白质有238个,显著性降低的蛋白质有235个,这些蛋白质中的一些可能是参与了分子调控过程的关键蛋白因子,如肝细胞癌抑制因子组氨酸磷酸酶在治疗有效病人中显著提高,可能作为蛋白标志物,提高索拉非尼药物治疗的响应率。对显著性差异蛋白进行基因本体注释,结果表明这些差异表达的蛋白质中的一些参与细胞分子调节和信号转导途径。该分析为研究索拉非尼治疗肝细胞(HCC)的分子机制提供了非常有意义的线索。我们对全文进行总结,讨论新建立的预分离方法优点,创新性和局限性,并展望蛋白质组学在精准医学研究和应用的发展前景。