基于适体识别技术检测中药中赭曲霉毒素A

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适体是近几年来通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)体外筛选得到的一类与目标分子高亲和力、高特异性结合的寡聚核苷酸片段。作为一个优于抗体的新型识别分子,适体已在食品快速检验、环境检测、新药研发、临床诊断和治疗以及毒理研究等领域展示了良好的应用前景。但在真毒毒素领域的应用刚刚起步,特别是中药材等复杂基质中的应用国内外还处于空白。赭曲霉毒素A(OTA)是由曲霉菌(Aspergillus)属和青霉菌(Penicillium)属等菌株代谢产生,具有强烈的肾毒性,致癌、致畸、致突变等作用。研究表明,OTA不仅广泛污染于农作物及食品中,近年来甘草、香辛料等中草药中也被证实广泛存在。因此,鉴于OTA普遍性和危害性,应该建立有效的快速检测方法,以控制中药中OTA的污染,为制定合理的限量标准提供依据。传统的基于免疫亲和柱净化的检测技术不能达到快速筛查,简便、经济的目的。本文基于适体识别技术自制了适体亲和柱,首次用于中药中OTA的净化。同时借助于先进的分析技术,建立了多种中药中OTA的快速检测方法,AAC用于中药等复杂基质净化的方法特异性强、操作简单、快速,经济,可用于大量样品的快速筛查。主要研究内容和结论如下:  (1)筛选了特异性吸附OTA的适体DNA序列,优选了偶联方式,首次制备了OTA适体亲和柱(AAC),并对制备的AAC性能进行了考察。  根据文献报道,合成了不同真菌毒素适体DNA序列,考察了它们吸附OTA的特异性,结果显示,Apt-1(5-NH2-(CH2)6-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAAAGG GAG CAT CGG ACA-3)为OTA特异性适体DNA序列;采用NHS-activatedsephaorse4FF为载体,室温摇床微微震摇反应3h为共价偶联条件;AAC最大吸附量达到188.96±10.56 ng。说明该制备方法特异性强、吸附量大、批间差异小、简单、快速、条件温和。  (2)首次建立了AAC净化超高效液相色谱-荧光检测法检测姜粉中OTA及质谱确证,并随机对市场上姜粉样品的污染状况进行了调查。  姜粉样品经乙腈-水(60∶40,v/v)混合溶剂提取,通过AAC净化,用超高效液相色谱-荧光检测器(UPLC-FLR)进行快速检测,并以UFLC-MS/MS对阳性样品进行确证。该法检测限为0.5μg/kg,在5-45μg/kg添加水平下,回收率范围在81.40-98.36%之间,RSD为2.18-4.26%,在25批样品中,13批样品为阳性,污染水平在1.51-4.31μg/kg之间,方法的准确性和IAC具有很好的相关性,而AAC重复利用性是IAC的两倍。该方法简单、快速(OTA保留时间<4 min)准确、经济,可用于大量样品的快速筛查。  (3)首次建立了涡旋辅助固相微提取-适体亲和柱净化-超高压液相色谱-串联质谱法快速检测中药中OTA,并考察了AAC柱在中药中的适用性及其基质效应。  样品经乙腈-水(60∶40,v/v)混合溶剂涡旋辅助微提取后,通过AAC净化,采用UFC-MS/MS法快速定性、定量测定。m/z404.2→358.0和m/z404.2→239.1分别为OTA定性和定量离子对,ESI+为质谱离子源,扫描方式为多反应检测-信息关联采集-增强型子离子扫描的组合扫描方式(MRM-IDA-EPI),以OTA和内标丁螺环酮峰面积的比值对OTA的浓度作线性回归,线性范围0.2-20 ng/mL,不同基质中的检测限在0.5-0.8μg/kg之间,在4-100μg/kg添加水平下,回收率为80.26-96.64%,RSD低于6.0%。在筛选的65种易被真菌污染的中药材中,AAC适用性达到了72.3%,基质效应达到了检测要求。AAC净化的方法特异性强、操作简单、快速、可靠性强,适用于诸如中药等复杂基质中OTA的净化。
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