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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的高度传染性疾病,PRRS被世界动物卫生组织定为二类传染病。2006年,发生在中国的以猪高热为特征,死亡率极高的疫情,经过病原分离鉴定验证与PRRSV非结构蛋白2(Non-structural protein 2,NSP2)变异毒株有关,并定名为“猪高致病性蓝耳病”(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,HP-PRRS)。2007年,我国开始采取HP-PRRS灭活疫苗对猪强制免疫的措施,虽然取得了一定的成效,但由于猪体对PRRSV的免疫主要依靠细胞免疫,灭活疫苗保护力有限。为解决这一问题,开展的针对HP-PRRSV减毒活疫苗的研发成为近年来的研究热点。2006年10月,中国兽医药品监察所从广东省发病猪群中分离到一株HP-PRRSV,命名为PRRSV GD株,并在Marc-145细胞上进行了传代致弱研究。本研究以PRRSV GD株5代和100代细胞传代毒为研究对象,由PRRSV GD株5~100代间11个代次全基因序列测序分析、细胞接种及PRRSV GD株5代与100代动物接种,研究PRRSV GD株5代与100代基因突变与其细胞适应性及动物毒力的关系;应用抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)技术和斑点杂交(Dot blot)技术研究感染5代、100代PRRSV GD株Marc-145细胞的基因差异表达;利用RNAi (RNA interference)技术和过量表达技术调控差异表达基因,研究基因调控对PRRSV GD株5代与100代增殖的影响等3部分构成,取得以下结果:1.利用RT-PCR对PRRSV GD株5代和100代及其他9个代次(参考用)的PRRSV GD株传代毒进行全基因测序分析;并分别将上述11个代次的PRRSV GD株等量滴度接种Marc-145细胞,观察细胞病变(cytopathic effect,CPE)出现时间,测定75% CPE时各代次病毒滴度;进行PRRSV GD株5代与100代动物接种试验3个方面来研究PRRSV GD株100代较5代基因突变对其细胞适应性和动物毒力影响。结果:PRRSV GD株100代较5代发生29个碱基突变,18个氨基酸突变,其中66.67%氨基酸突变发生于ORF1上;CPE出现时间减少10 h,病毒滴度负对数值增加2;接种试验动物临床症状轻,主要嗜性组织器官抗原降低20%。表明:PRRSV GD株100代与5代在细胞适应性和动物毒力上存在明显差异,可能与PRRSV GD株100代较5代发生在ORF1突变有关。2.利用SSH技术和斑点杂交技术,研究12h、24h、36h,3个时间点感染PRRSV GD株5代和100代的Marc-145基因表达差异,进一步通过研究PRRSV GD株5代与100代对宿主细胞Marc-145的基因表达影响的基因表达影响用以研究2个代次毒株差异。结果:成功筛选出11个EST序列,包括:S8、S29、RPL6、RPL26、RPL30,5个核糖体蛋白基因序列;4个未知基因和2个与代谢相关的酶类:DEAD-BOX多肽、内切葡聚酶。其中PRRSV GD株100代较5代感染的Marc-145一直存在核糖体蛋白S8基因的差异表达。表明:感染PRRSV GD株100代和5代的Marc-145细胞基因转录情况确实存在差异,其中S8基因可能与PRRSV GD株细胞适应性差异或毒力有关。3.利用RNAi和过量表达技术,对S8基因设计shRNA序列,扩增核糖体蛋白S8基因转录子I序列,并分别构建psiRNA-hH1neo和pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体,转染至Marc145细胞中,用G418抗性筛选稳定细胞系。使用Real-time PCR和western-blot验证稳定细胞系中核糖体蛋白S8基因抑制和过量表达效果,将PRRSV GD株5代和100代分别接种2个细胞系,设立control和mock对照组,利用Real-time PCR和免疫荧光检测。结果:当核糖体蛋白S8基因受抑制时,GD株5代和100代出现不同程度的增殖降低;核糖体蛋白S8基因过表达时GD株5代和100代出现不同程度的增殖提高。表明: Marc-145核糖体S8基因调控与PRRSV GD株增殖的具有相关性。