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目的:由于骨髓中血流缓慢,并含有大量生长因子和细胞因子有助于肿瘤细胞的侵袭和转移,因此骨组织是乳腺癌和前列腺癌等癌症的好发转移部位之一。近年来对原发性乳腺癌的治疗取得了较大的进步,明显延长了患者的生存时间,但同时也增加了乳腺癌患者发生骨转移的几率,有大量研究表明超过60%的晚期乳腺癌患者会发生骨转移。在骨转移部位由肿瘤细胞产生大量的细胞因子和生长因子直接激活破骨细胞,增加骨重吸收,使骨质遭到严重破坏,并使骨基质中的各种生长因子释放到肿瘤组织中,促进肿瘤迅速生长;而肿瘤的生长进一步加剧了骨重吸收,形成肿瘤生长与骨重吸收之间的恶性循环,严重影响骨转移瘤的预后。另外,肿瘤转移到骨会引起一系列的骨相关事件,如骨痛、病理性骨折、高钙血症和脊髓压迫等,严重降低患者生活质量,缩短生存时间。由于骨组织特殊的生理结构,硬度大、药物渗透量低,使得化疗的应用和疗效受到限制。阿霉素(DOX)是治疗乳腺癌的有效药物,但是其毒副作用显著,因此开发一种既能抑制骨的重吸收又能抑制骨转移瘤生长的DOX高效递药系统,对于治疗乳腺癌骨转移瘤具有重要意义。方法:1.以阿仑膦酸钠(ALN)为骨靶向配体,以透明质酸(HA)为肿瘤靶向配体兼胶束亲水端材料,以聚乙二醇(PEG)为ALN和HA之间的桥联剂,以聚天冬氨酸(PASP)为胶束疏水端材料,三者之间通过腙键连接,制备HA-PASP和ALN-HA-PASP,采用胱胺将ALN-HA-PASP分子通过二硫键交联,得到ALN-(HA-PASP)CL,并进行结构鉴定。采用透析法制备载阿霉素(DOX)pH响应胶束DOX@HA-PASP和DOX@ALN-HA-PASP,以及具有pH及氧化还原响应的载DOX核壳交联胶束DOX@ALN-(HA-PASP)CL。2.通过改变温度、蒸馏水量、疏水端比例、投药量优化制备胶束的条件。3.采用荧光分光光度计测定胶束的载药量(DL)、包封率(EE)、临界胶束浓度(CMC);采用zeta电位及纳米粒度分析仪检测胶束粒径、zeta电位和稳定性;采用透射电镜(TEM)观察胶束形态。4.利用透析法结合荧光分光光度计观察胶束在不同介质中的释药特性。5.利用活体成像仪观察骨碎片对胶束的吸附和解吸附。6.MTT法测定载药胶束对MDA-MB-231细胞的细胞毒性;利用流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察MDA-MB-231细胞和RAW264.7细胞对胶束的摄取。7.在体外采用新生小鼠颅骨和MDA-MB-231细胞在无菌条件下共孵育构建乳腺癌骨转移瘤3D模型,通过扫描电镜(SEM)判断载药胶束对骨重吸收的影响;通过中性红染色观察载药胶束对破骨细胞活性的影响;通过中性红硝酸银复染观察载药胶束作用后对骨重吸收程度的影响;通过结晶紫染色观察载药胶束对骨转移瘤模型中肿瘤细胞抑制情况。8.通过骨髓腔注射MDA-MB-231细胞建立乳腺癌骨转移瘤裸鼠模型,通过测定荷瘤裸鼠体重,肿瘤体积及H&E切片染色评价载药胶束的体内抗肿瘤活性及体内系统毒性;利用活体成像仪和冰冻切片观察给药后DOX在荷瘤裸鼠体内的分布情况;通过Micro-CT观察肿瘤部位骨质的破坏程度。结果:1.通过1H NMR和IR鉴定,所合成的HA-PASP、ALN-HA-PASP和ALN-(HA-PASP)CL为目标产物。2.在温度为80°C,蒸馏水量为30 m L,疏水端PASP投料量为30%,材料与药物投量比为10:3(mg/mg)的条件下,通过透析法制备出的三种胶束DOX@HA-PASP,DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL粒径分别为95.3±7.2 nm,101.5±10.3 nm和110.8±9.2 nm;zeta电位分别为-19.0±3.4 mV,-13.9±4.1 m V和-16.3±2.7 mV;载药量分别为11.3±2.7%,9.8±2.4%和14.6±3.2%;TEM结果显示三种胶束均呈球形。3.DOX@ALN-HA-PASP在pH5.0的介质中,10 h内累积释药量为90%;在pH7.4的介质中,10 h内的累积释药量为35%,表明DOX@ALN-HA-PASP体外释药具有酸敏性。DOX@ALN-(HA-PASP)CL在0.1μM GSH(pH7.4)介质中,60 h内的累积释药量为35%;在10 mM GSH(pH7.4)和0.1μM GSH(pH5.0)两种条件下,60 h内的累积释药量均为60%左右,而在10 mM GSH(pH5.0)中,60 h内的累积释药量高达90%,说明DOX@ALN-(HA-PASP)CL体外释药具有酸敏性和GSH敏感性。4.骨碎片对经ALN修饰DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL的吸附作用明显高于未经ALN修饰的DOX@HA-PASP。DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL在pH5.0的条件下有良好的骨解吸附性。利用荧光分光光度计观察到在pH5.0的酸性环境下胶束表面ALN脱落,提示胶束从骨表面解吸附是由于ALN脱落造成。5.相比于DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL,MDA-MB-231细胞对DOX@HA-PASP的摄取最多,DOX@HA-PASP对MDA-MB-231细胞的细胞毒性最强;在pH6.5的条件下,细胞能增加对DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL的摄取;另外,添加游离HA能够减少MDA-MB-231细胞对DOX@HA-PASP的摄取。上述结果提示HA在促进肿瘤细胞摄取胶束以及增强胶束的细胞毒性方面发挥重要的作用。6.通过流式细胞术观察RAW264.7细胞对胶束的摄取,结果显示RAW264.7细胞对DOX@ALN-HA-PASP的摄取量明显少于DOX@HA-PASP,说明ALN-PEG修饰能有效减少巨噬细胞的吞噬。7.采用流式细胞术观察到网格蛋白摄取途径抑制剂蔗糖可明显减少MDA-MB-231细胞对胶束的摄取,说明胶束是通过网格蛋白介导的内吞被MDA-MB-231细胞所摄取。8.体外骨转移瘤3D模型结果显示DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL通过抑制破骨细胞活性,发挥良好的抗骨重吸收以及抑制肿瘤细胞活性的作用。9.体内抗肿瘤实验结果显示,DOX@ALN-(HA-PASP)CL抑制肿瘤生长的作用明显强于DOX@HA-PASP和DOX@ALN-HA-PASP;从H&E染色结果可以看出DOX有明显的心脏毒性,而DOX@ALN-(HA-PASP)CL和DOX@ALN-HA-PASP几乎没有心脏毒性,且DOX@ALN-(HA-PASP)CL对肿瘤组织的毒性最强;活体成像和冰冻切片结果显示,DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL对骨转移瘤有良好的靶向作用,同时降低DOX在其他正常组织的分布;Micro-CT结果显示,经DOX@ALN-(HA-PASP)CL治疗后,骨转移瘤处的骨组织完整,与正常组之间无显著性差异,说明DOX@ALN-(HA-PASP)CL抑制骨重吸收的作用显著。结论:DOX@ALN-(HA-PASP)CL具有较高的载药量,对酸性和高GSH浓度环境有较强的响应。DOX@ALN-(HA-PASP)CL能更多的富集于骨转移瘤处,减少了DOX在其他正常组织的分布,从而提高了抗肿瘤作用,降低了全身毒副作用,并能有效抑制骨转移瘤部位骨的重吸收,提高了对乳腺癌骨转移瘤的整体治疗效果。