AS性缺血性心、脑血管疾病凭借其高发病率、高致残率、高致死率,严重危害人类的生命健康。目前,促进AS斑块的稳定性是防治心脑血管疾病的主要方法之一。炎症反应贯穿AS的整个病理过程,炎症所介导的脂质、能量代谢异常、氧化应激、内皮损伤、细胞凋亡等直接增加了AS斑块的不稳定性,提高了急性血管事件的发生率。近年来,越来越多的研究发现,基于抗击炎症的治疗方法能够有效延缓AS的进展、减少AS性疾病的发生。巨噬细胞通过分泌大量炎性介质,如细胞因子、趋化因子、黏附分子、基质金属酶等在AS炎症反应中发挥重要作用。在不同的刺激条件下,巨噬细胞可极化为促炎亚型(M1)或抗炎亚型(M2)。近年来,通过干预巨噬细胞极化的各个环节,抑制巨噬细胞向M1亚型极化,促进巨噬细胞向M2亚型极化逐渐成为AS及AS相关疾病防治的新策略。研究证实,ox LDL是促使AS炎症反应启动和放大的重要致损因素,ox LDL能够通过诱导巨噬细胞活化为促炎的M1型,介导一系列炎症反应的发生。尽管目前已经发现一些信号通路参与调节ox LDL诱导的巨噬细胞极化,但具体机制尚未完全明确。因此,为了深入了解ox LDL影响巨噬细胞极化的可能机制,为AS性疾病的防治提供新的思路,我们进行了以下三部分研究:第一部分ox LDL对巨噬细胞极化影响的研究目的:探究ox LDL对不同种属来源巨噬细胞表型标志物及相关细胞因子表达的影响,明确ox LDL诱导巨噬细胞极化的方向。方法:(1)给予小鼠RAW264.7巨噬细胞不同浓度ox LDL处理,检测M1、M2亚型相关表型标志物、细胞因子的表达与分泌水平。(2)给予人THP1巨噬细胞不同浓度ox LDL处理,检测M1、M2亚型相关表型标志物、细胞因子的表达水平。(3)诱导冠心病、急性大动脉粥样硬化性脑梗死患者及健康供者外周血中的单个核细胞为原代巨噬细胞,给予ox LDL处理,检测M1、M2亚型相关表型标志物及细胞因子的表达水平,并观察细胞的形态变化。结果:(1)ox LDL处理后,小鼠RAW264.7巨噬细胞中M1表型标志物i NOS及M1相关细胞因子TNF-α、IL-1β、MCP1的m RNA水平与蛋白水平明显高于对照组,具有显著性差异,p<0.05;小鼠M2表型标志物Arg1的m RNA水平与对照组无显著性差异,p>0.05,但其蛋白水平明显低于对照组;M2相关细胞因子VEGF的表达仅在高浓度ox LDL处理时高于对照组,具有显著性差异,p<0.05。(2)ox LDL处理后,人THP1巨噬细胞中i NOS及TNF-α表达明显高于对照组,具有显著性差异,p<0.05;人M2表型标志物CD206及相关VEGF的表达无显著性差异,p>0.05。(3)ox LDL处理后,人原代巨噬细胞中M1相关基因的表达高于对照组;CD206的表达低于对照组,但VEGF的表达高于对照组;ox LDL处理后,原代巨噬细胞形态发生明显改变。结论:ox LDL诱导不同种属来源的巨噬细胞向M1亚型而不是M2亚型极化。第二部分ox LDL通过NF-κB-HIF-1β信号通路诱导巨噬细胞极化的研究目的:通过抑制巨噬细胞中NF-κB及HIF-1β表达,探究二者在转录水平上对ox LDL诱导巨噬极化的调控作用及机制。方法:(1)采用不同时间/浓度梯度ox LDL处理小鼠RAW264.7巨噬细胞,检测NF-κB信号通路的活化水平。(2)采用PTL预处理抑制NF-κB活性后,检测ox LDL对小鼠巨噬细胞表型标志物及细胞因子表达水平的影响。(3)诱导冠心病、急性大动脉粥样硬化性脑梗死患者及健康供者外周血中的单个核细胞为原代巨噬细胞,PTL预处理后,检测ox LDL对巨噬细胞中M1、M2相关基因表达水平的影响,并观察细胞形态变化。(4)不同时间/浓度梯度ox LDL处理小鼠巨噬细胞,检测HIF家族蛋白表达水平。(5)采用sh RNA沉默小鼠巨噬细胞中HIF-1β,检测ox LDL对巨噬细胞表型标志物及细胞因子表达水平的影响。(6)分别抑制巨噬细胞中NF-κB与HIF-1β的表达,探究ox LDL条件下NF-κB与HIF-1β之间的相互调节作用。结果:(1)ox LDL处理后,小鼠巨噬细胞中NF-κB信号通路中的经典途径及非经典途径均被激活。(2)PTL预处理能够削弱ox LDL诱导的小鼠巨噬细胞中M1相关基因的表达,促进M2相关基因表达,具有显著性差异,p<0.05。(3)PTL预处理能够削弱ox LDL诱导的人原代巨噬细胞中M1相关基因及VEGF的表达,促进M2相关CD206表达增加,并阻断ox LDL诱导的细胞形态改变。(4)ox LDL处理提高小鼠巨噬细胞中HIF的蛋白表达水平。(5)sh RNA沉默巨噬细胞中的HIF-1β能够削弱ox LDL诱导的M1相关基因的表达,促进M2相关基因表达升高,具有显著性差异,p<0.05。(6)抑制NF-κB活化后,HIF-1β表达受抑制;沉默HIF-1β后,NF-κB活化不受影响。结论:(1)NF-κB与HIF-1β参与调控ox LDL诱导巨噬细胞向M1型极化。(2)抑制NF-κB、HIF-1β能够调控ox LDL诱导的巨噬细胞向M2亚型方向极化。(3)NF-κB位于HIF-1β上游,调控HIF-1β的表达。第三部分ox LDL通过KDM4A/JMJD2A诱导巨噬细胞极化的研究目的:通过沉默去甲基化酶KDM4A的表达,探究KDM4A在表观遗传水平上参与调控ox LDL诱导巨噬极化的机制。方法:(1)采用不同时间/浓度梯度ox LDL处理小鼠RAW264.7及THP1巨噬细胞,检测KDM4A的表达水平。(2)采用sh RNA沉默小鼠巨噬细胞中的KDM4A,检测ox LDL对巨噬细胞表型标志物及细胞因子表达水平的影响。(3)分别抑制小鼠巨噬细胞中NF-κB、HIF-1β和KDM4A的表达,探究ox LDL条件下KDM4A表达与NF-κB-HIF-1β信号通路之间的相互作用。(4)采用KDM4A抑制剂JIB-04,处理小鼠巨噬细胞,检测细胞凋亡情况,探究KDM4A在维持巨噬细胞生存中的作用。结果:(1)ox LDL处理明显增加小鼠RAW264.7及人THP1巨噬细胞KDM4A的表达水平。(2)sh RNA沉默巨噬细胞中的KDM4A能够削弱ox LDL诱导的M1相关基因的表达,促进M2相关基因表达升高,具有显著性差异,p<0.05。(3)KDM4A的表达不依赖于NF-κB-HIF-1β信号通路,反之亦然。(4)JIB-04处理能够增加巨噬细胞凋亡率,ox LDL部分削弱JIB-04介导的凋亡,具有显著性差异,p<0.05。结论:(1)KDM4A参与调控ox LDL诱导巨噬细胞向M1型极化。(2)KDM4A的表达与NF-κB-HIF-1β信号通路相互独立。(3)KDM4A参与调控巨噬细胞存活。