论文部分内容阅读
目的研究胚胎后肾间充质细胞（metanephric mesenchymal cells,MMCs）尾静脉移植对阿霉素（Adriamycin,ADR）慢性肾病大鼠损伤肾脏的再生修复作用及其可能机制。方法1.大鼠胚胎后肾间充质细胞的分离、培养及鉴定。取孕13天大鼠胚胎,分离胚胎肾脏,去除输尿管芽,消化后置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。倒置相差显微镜下观察培养细胞,并行HE染色、电镜观察、生长曲线测定;ABC免疫酶染色法检测波形蛋白、角蛋白、nestin、CD133、CD34;直接免疫荧光法检测双花扁豆凝集素（Dolichos Biflorus,DB）,并流式细胞术定量检测。2.大鼠胚胎后肾间充质细胞的体外标记方法探讨。分别将4′,6-二脒-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）、DAPI体外标记MMCs、绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）体外标记MMCs,通过尾静脉注入阿霉素肾病大鼠体内;于细胞移植后1w、3w、5w行肾组织冰冻切片,观察DAPI及GFP荧光分布,并ABC免疫酶染色法检测肾组织中GFP表达。3.从细胞分化的角度,探讨尾静脉细胞移植对阿霉素肾病大鼠的修复改善作用。（1）分别以含阿霉素。肾病大鼠血清及肾组织匀浆的培养基,体外诱导培养后肾间充质细胞,采用细胞免疫化学方法检测细胞角蛋白（cytokeratin,CK）、角蛋白-18（cytokeratin-18,CK-18）、波形蛋白、维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）表达。（2）通过尾静脉注射移植GFP标记MMCs至阿霉素肾病大鼠,CK及GFP双标记观察MMCs的归巢及分化情况。（3）检测阿霉素大鼠细胞移植前后24小时尿蛋白定量、24小时尿肌酐定量、血清白蛋白、总胆固醇、尿素氮、肌酐、肾小管损伤指数及肾小球硬化面积等指标,并计算内生肌酐清除率,了解MMCs对肾功能的影响。4.探讨胚胎后肾间充质细胞移植对阿霉素肾病大鼠的治疗作用。90只体重200～220g Sprague-Dawley大鼠随机分成3组:阿霉素肾病组（ADR group,n=40）:采用阿霉素二次注射法,间隔3周,每次剂量为0.25 mg/100 g体重;MMCs细胞移植组（ADR-MMCs group,n=40）:于第二次阿霉素注射后8周,尾静脉注入MMCs,剂量为每只大鼠5～7×106;正常对照组（control group,n=10）。于阿霉素注射后16周杀鼠,留取标本行血、尿生化检测、肾组织病理学分析,免疫组化法检测肾组织Ⅳ型胶原、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2,MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9,MMP-9）的表达,并Western blot及RT-PCR进一步检测肾组织MMP-2、MMP-9的蛋白及基因定量。结果1.MMCs形态为成纤维细胞样,贴壁生长,48～72小时达生长高峰;波形蛋白、nestin、CD133表达阳性;角蛋白、CD34、DB表达阴性;MMCs以DB标记后流式细胞检测为单峰。2.（1）DAPI标记细胞及单纯DAPI尾静脉注射后1周,均可在肾小管上皮细胞中观察到DAPI阳性细胞,至移植后5周仍可观察到,但随时间延长荧光有减弱趋势。（2）GFP标记细胞移植后1周,可在肾小管上皮细胞中观察到GFP阳性细胞,至移植后5周仍可观察到,荧光无明显减弱。（3）ABC免疫酶染色法检测,显示GFP阳性细胞主要表达于近端肾小管中,肾小球系膜区亦可观察到少量表达;GFP阳性产物主要表达于胞浆。GFP表达半定量评分显示,标记细胞的早期应用阳性率大于晚期应用者,且随观察时间延长,阳性率有升高趋势。3.（1）MMCs在阿霉素肾病大鼠血清及匀浆体外诱导培养下,均可检测到CK-18、VDR阳性表达。（2）GFP标记MMCs移植后1周,于阿霉素肾病大鼠肾小管及肾小球中,均可检测到GFP、CK双标记阳性细胞。（3）阿霉素肾病大鼠MMCs移植后,内生肌酐清除率提高,但其它指标检测（24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇、肾小管损伤指数及肾小球硬化面积）与细胞移植前比较,均无显著性差异。另外,血尿素氮、肌酐在阿霉素作用前后无显著性差异。4.与阿霉素组比较,细胞移植组大鼠肾组织Ⅳ型胶原沉积减少、MMP-2蛋白表达下调、MMP-9蛋白表达升高,并有显著性差异（P＜0.05）;相关分析显示,Ⅳ型胶原沉积与MMP-2蛋白表达存在正相关,而与MMP-9蛋白表达呈负相关（P＜0.05）;血、尿生化指标检测同第三部分类似,细胞移植组与阿霉素组在24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇、肾小管损伤指数及肾小球硬化面积检测上,均无显著性差异。另外,血尿素氮、肌酐在大鼠阿霉素作用前后无显著性差异。结论1.培养细胞为后肾间充质细胞,纯度及稳定性较高并符合干细胞特征。2.MMCs的脂质体感染法GFP标记,是一便捷、有效的体外标记方法,适于移植细胞的短期内示踪、观察,并可为其它干细胞移植提供参考。3.在阿霉素肾病大鼠,细胞移植的疗效观察应有一更长的时间;细胞移植能否促进肾脏修复、最终改善肾功能,仍有待进一步的探讨。4.MMCs移植对改善阿霉素肾病大鼠肾组织纤维化有促进作用,基质蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）降解途径的激活可能在其中发挥了作用。