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4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)是一种自然界存在的非蛋白质氨基酸,具有促进胰岛素分泌等作用。目前主要采用葫芦巴种子提取法生产4-HIL,然而该方法提取效率低(0.091-0.6%)且采用该方法获得的4-HIL构型较多但仅(2S,3R,4S)-4-HIL具有生物学活性。研究表明L-异亮氨酸羟化酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)能够特异性催化异亮氨酸生成(2S,3R,4S)-4-HIL。因此,本文以来源于苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis TCCC11826中的ido基因为研究对象,研究采用生物法合成4-HIL,以探索更高效合成4-HIL策略。本文从苏云金芽孢杆菌TCCC11826中成功克隆ido基因,测序显示其核苷酸和氨基酸序列与已报道的相似度分别为97.47%和97.91%。分别以大肠杆菌Escherichia coli W3110 和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032 为宿主菌株成功构建ido过表达菌株W3110/pXMJido和ATCC13032/pXMJido用于微生物转化法合成4-HIL。结果显示在添加α-酮戊二酸和L-异亮氨酸条件下,两菌株对L-异亮氨酸的转化率分别为89.28%和56.7%。IDO催化合成4-HIL需要以L-异亮氨酸及α-酮戊二酸为底物。为减少底物的添加并简化合成工艺,以L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW为宿主成功构建ido表达菌株YILW/pXMJido用于发酵法合成4-HIL。结果表明,该菌株在仅添加α-酮戊二酸条件下,发酵50h4-HIL产量为2.01±0.04g/L,但有一定量L-异亮氨酸积累,暗示可能是由于α-酮戊二酸供应量不足致使菌株合成的L-异亮氨酸未被消耗。研究了发酵过程中添加不同量α-酮戊二酸对4-HIL合成的影响。结果表明在一定范围内4-HIL产量随α-酮戊二酸添加量的增加而升高,最高达4.85 g/L,即通过提高α-酮戊二酸供应量可有效增加4-HIL产量。因此采用增加菌株自身合成α-酮戊二酸能力的策略进一步减少底物的添加。采用基因重组技术敲除YILW/pXMJido α-酮戊二酸脱氢酶编码基因,以减少其α-酮戊二酸消耗,结果发现菌体生长及4-HIL产量均受到显著影响。采用强启动子替换策略过表达丙酮酸羧化酶基因编码基因pyc成功构建YILW(Ppyc::Ptuf)/pXMJido以增加α-酮戊二酸的合成,使得4-HIL产量提高40%。在此基础上,敲除异柠檬酸裂解酶编码基因aceA成功构建YILW(Ppyc::Ptuf)(aceA:Ptuf-ido)/pXMJido,该菌株4-HIL产量和糖酸转化率分别提高6.4%和10%。上述结果表明,增强CO2固定途径和阻断乙醛酸循环有助于提高胞内α-酮戊二酸的供应,进而提高4-HIL产量。本文研究了微生物转化法和发酵法合成4-HIL。前者具有生产周期短、转化率高等特性,但需添加底物α-酮戊二酸和L-异亮氨酸,不利用于生产成本的降低;后者无需添加底物,将L-异亮氨酸的发酵生产与4-HIL的合成相偶联,实现直接发酵法合成4-HIL,具有一定的优势。本研究可为延伸L-异亮氨酸的代谢途径以及4-HIL的生物制造技术奠定理论基础。