【摘 要】
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目的:通过原核表达的方法获取人TIMP-2蛋白,探讨TIMP-2在肝癌迁移及侵袭中的作用。方法:(1)以肝癌SMMC-7721细胞总RNA为模板,用RT-PCR技术获得目的基因,将目的基因克隆到载体
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目的:通过原核表达的方法获取人TIMP-2蛋白,探讨TIMP-2在肝癌迁移及侵袭中的作用。方法:(1)以肝癌SMMC-7721细胞总RNA为模板,用RT-PCR技术获得目的基因,将目的基因克隆到载体pMD18-T上;酶切鉴定和测序后将TIMP-2编码区导入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-TIMP-2,转化至大肠杆菌菌株Origami(DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达,采用亲和层析法纯化表达产物,用SDS-PAGE电泳检测并用western blot验证。(2)用RNAi技术和添加外源蛋白的方法分析TIMP-2蛋白对肝癌细胞SMMC-7721迁移和侵袭的影响;用siRNA-TIMP-2转染肝癌SMMC-7721细胞后,采用荧光定量PCR及western blot方法检测细胞内源性TIMP-2 mRNA及蛋白表达水平。结果:(1)成功构建原核重组表达载体pGEX-TIMP-2,并在原核宿主Origami中大量表达,并获得纯化的融合蛋白GST-TIMP-2。(2)与对照组相比,外源添加的TIMP-2蛋白抑制肝癌SMMC-7721细胞的迁移及侵袭能力(P<0.05);而siRNA-TIMP-2转染SMMC-7721细胞后,采用荧光定量PCR及western blot方法检测显示:TIMP-2mRNA以及蛋白水平表达下调(P<0.05),与对照组相比,SMMC-7721细胞的迁移及侵袭能力显著增强(P<0.05);肝星形细胞的条件培养液能够促进肝癌SMMC-7721细胞迁移和侵袭,而这种作用能够被TIMP-2蛋白抑制(P<0.05)。结论:成功克隆了人TIMP-2基因,得到体外重组蛋白;肝癌微环境中的TIMP-2蛋白水平与肝癌细胞的迁移和浸润密切相关。
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