卵巢癌（Ovarian cancer,OC）是常见的女性生殖系统恶性肿瘤,上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancers,EOC）是卵巢癌中最常见的类型。EOC具有诊断发现晚,易出现化疗耐药,五年生存率低等特点。EOC的诊治难点在于缺乏早期有效的诊断和预后评估方法和标记物,如何有效应对肿瘤耐药也是EOC治疗过程中的一个难点问题。探究EOC发病机制对于EOC患者的诊治有着重大意义。Gli（Glioma-associated oncogene homoglog）,是Hedghog（HH）信号系统中的关键的转录因子,包含不同亚型。HH信号系统的激活与多种肿瘤的发生、发展密切相关。近年来,研究认为HH信号系统与肿瘤干细胞关系密切,而Gli也同样被证明参与多种肿瘤干细胞的形成,因此Gli在肿瘤的发生、发展、耐药、复发中的作用也逐渐被重视。在一些肿瘤当中,NANOG可作为肿瘤干细胞标记物,而NANOG可能是Gli的下游因子,二者均与肿瘤的恶性行为、肿瘤干细胞的形成有关。目前关于Gli1和Gli2这两种具有HH通路激活作用的蛋白在EOC中作用的相关机制及其与肿瘤干细胞标志物NANOG在EOC中表达的相关性等问题尚无深入研究。本课题针对上述问题展开探讨,研究结果可为EOC的发病机制及治疗提供新的思路和策略。第一部分 上皮性卵巢癌中Gli和NANOG的表达及与临床特征相关性研究目的:以人上皮性卵巢癌组织中Gli及NANOG为研究对象,揭示Gli、Gli2与肿瘤干细胞标志物NANOG在上皮性卵巢癌中的表达水平,分析Gli与NANOG表达的相关性,研究Gli和NANOG表达及其与临床病理特点及预后的关系。方法:收集临床病理资料完整的61例上皮性卵巢癌患者石蜡标本作为研究对象,通过免疫组织化学法检测Gli1、Gli2以及NANOG蛋白在EOC中的表达,回顾性分析Gli1、Gli2、NANOG与EOC患者的临床病理资料的关系、Gli和NANOG表达水平的相关性以及以上三个蛋白在上皮性卵巢癌患者的预后中的作用。结果:1.EOC标本的临床病理资料特点本实验纳入的61例临床病理资料完善的EOC患者蜡块组织标本,其中50岁以下患者为20例（32.8%）,50岁及以上患者为41例（67.2%）。根据组织学分类,浆液性卵巢癌为最常见组织类型,共38例（62.3%）,其次为子宫内膜样卵巢癌10例（16.4%）,粘液性卵巢癌10例（16.4%）。23例（37.7%）患者合并淋巴结转移,病理分级为G2-3共40位（65.6%）,在61例患者中,44例（72.1%）对铂类敏感,17例（27.9%）对铂类化疗原发耐药。2.Gli1、Gli2、NANOG蛋白在EOC组织中的表达情况与EOC患者临床病理参数的相关性在细胞质中Gli1+为38例（62.3%）,铂耐药患者阳性表达率更高（P<0.05）,且随着EOC患者手术病理分期的升高其阳性表达率升高（P<0.05）。Gli1细胞核表达阳性者12例（19.7%）,其表达与EOC患者临床病理参数无相关性。细胞质Gli2+为34例（55.7%）,Gli2的细胞质表达与EOC患者的临床病理参数无相关性。Gli2细胞核表达阳性者36例（59.0%）。在铂耐药病例中,Gli2的细胞核表达阳性率升高（P<0.001）。NANOG的表达位置主要位于细胞质,NANOG+为36例（59.0%）。随着手术病理分期的升高,NANOG的表达率增高（P<0.001）,其在铂耐药病例中的阳性表达率增高（P<0.05）3.EOC中Gli1、Gli2与NANOG蛋白表达的相关性细胞质中Gli1蛋白的表达与NANOG蛋白的表达呈正相关（r=0.796,P<0.001）。在细胞质中Gli2蛋白的表达与NANOG呈正相关（r=0.264,P=0.039）。Gli1、Gli2在细胞核的表达情况与NANOG表达无相关性（P>0.05）。4.Gli1、Gli2、NANOG蛋白的表达对患者生存率的影响Kaplan-Meier分析显示细胞质Gli1阳性表达、细胞核Gli2阳性表达以及NANOG阳性表达与EOC患者的总体存活率显著负相关,与细胞质Gli1阴性、细胞核Gli2阴性及NANOG阴性的患者相比,总体存活时间较短（P=0.003,P=0.001,P<0.001）。cox回归方法分析显示细胞核Gli2+（P=0.001;HR,2.896;95%CI,1.520-5.517）与NANOG+（P=0.002;HR,2.857;95%CI,1.470-5.550）为EOC患者的独立预后因素。小结:在EOC组织中,细胞质中Gli1、NANOG的表达水平与手术-病理分期、对铂类药物的敏感性相关。细胞核Gli2的表达水平与铂类药物敏感性相关。细胞质中Gli1、Gli2的表达与NANOG在EOC组织中的表达正相关;细胞质Gli1、细胞核Gli2以及NANOG的阳性表达的上皮性卵巢癌患者预后更差,细胞核Gli2与NANOG的表达为上皮性卵巢癌的独立预后因素。因此Gli1、Gli2、NANOG可能为上皮性卵巢癌潜在肿瘤标志物,对上皮性卵巢癌患者预后有重要意义。第二部分 抑制或激活HH信号通路对上皮性卵巢癌细胞生物学特性的影响及其相关机制目的:应用HH信号通路抑制剂GANT61和HH信号通路激动剂SHH分别作用于上皮性卵巢癌细胞,观察肿瘤细胞的增殖、克隆形成力、迁移、侵袭、对顺铂药物敏感性以及相关的分子表达情况,探讨Gli对上皮性卵巢癌细胞的影响,并对其调控机制进行研究。方法:通过对上皮性卵巢癌细胞中分别添加作用于Gli的HH信号通路抑制剂GANT61和HH信号通路激动剂SHH,观察上皮性卵巢癌SKOV3细胞的增殖、克隆形成能力、迁移性、侵袭性以及顺铂敏感性方面的改变,应用qRT-PCR及Western blot方法对Gli1、Gli2、干细胞标记物NANOG、多重耐药蛋白MDR1、上皮性标记物E-cadherin的m RNA及蛋白表达情况的影响。每组实验重复三次。所有数据应用SPSS 17.0和Graph Pad Prism5.0统计软件处理,P<0.05为有显著差异。结果:1.HH通路激动剂及抑制剂对SKOV3细胞增殖能力的影响CCK-8测定结果表明GANT61处理组细胞出现增殖率下降,并呈时间与药物浓度依赖性,100umol/l GANT61作用24小时,50umol/l、100umol/l GANT61作用48小时,20umol/l、50umol/l、100umol/l GANT61作用72小时后,均会引起OD值下降,差异均具有统计学意义。而SHH处理组细胞的增殖率与对照组相比在各时间点及各浓度均未出现明显差异。2.HH通路激动剂及抑制剂对SKOV3细胞克隆形成能力的影响平板克隆实验结果表明,GANT61处理组的克隆形成能力较对照组降低（69.6±2.35%vs25.1±2.27%）,SHH处理组细胞的克隆形成率较对照组降低,（69.6±2.35%vs58.3±3.13%）,差异均有统计学意义。3.HH通路激动剂及抑制剂对SKOV3细胞迁移性和侵袭性的影响Transwell迁移及侵袭实验结果显示,GANT61处理组的SKOV3细胞的穿膜细胞数明显少于阴性对照组,而SHH处理组SKOV3细胞的穿膜细胞数与阴性对照组相比出现增长,差异有统计学意义（P<0.05）。4.HH通路激动剂及抑制剂对SKOV3细胞顺铂敏感性的影响应用CCK-8方法测定GANT61及SHH处理组与对照组对于顺铂敏感性的变化。结果表明,随着顺铂处理时间及浓度增加,各组的细胞增殖率减低。GANT61处理组在各时间点的IC50较对照组均降低（P<0.05）。而SHH处理组在各时间点的顺铂IC50与未处理组相比均无明显变化。5.HH通路激动剂及抑制剂对相关分子表达的影响应用qRT-PCR及Western blot方法检测不同处理组相关分子的表达。结果表明相较于未处理组,GANT61处理组的Gli1、Gli2的m RNA及蛋白表达均出现下降,NANOG和MDR1的表达也出现降低,E-cadherin出现增高（P<0.05）。在SHH组中,相对于未处理组,Gli1、Gli2、E-cadherin的表达情况并无明显变化,而NANOG和MDR1出现增高（P<0.05）。小结:1.Gli参与调控上皮性卵巢癌SKOV3细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力和顺铂耐药性,抑制Gli的表达可减弱以上生物学功能。2.GANT61对于上皮性卵巢癌细胞恶性行为的改变降低了肿瘤细胞的“干性”,可能通过其抑制Gli后对于NANOG产生抑制而实现。3.SHH对于SKOV3细胞的多种恶性生物学行为未能产生明显影响,甚至会引起某些生物学行为的减弱,这表明在上皮性卵巢癌中可能同时存在经典及非经典的HH信号途径。第二部分 沉默Gli1基因对卵巢癌细胞生物学特性的影响及其机制的探讨目的:从肿瘤细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭及对顺铂药物反应等方面观察Gli的重要亚型Gli1对上皮性卵巢癌细胞生长特性的影响,并对其调控机制进行研究。方法:通过对SKOV3细胞株转染Gli1 siRNA沉默Gli1基因表达,采用qRT-PCR及Western blot对转染效率进行测定,通过体外实验观察沉默Gli1对上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及对顺铂敏感性等方面的影响,检测基因沉默后Gli2、干细胞标记物NANOG、多重耐药蛋白MDR1、上皮性标志物E-cadherin等蛋白的表达及m RNA水平的表达变化。每组实验重复三次。所有数据应用SPSS 17.0和Graph Pad Prism5.0统计软件处理,P<0.05为有显著差异。结果:1.Gli1基因转染效率测定qRT-PCR结果显示,SKOV3细胞转染Gli1 siRNA后,干扰转染序列均有效抑制Gli1 m RNA的表达,与阴性对照组相比m RNA分别下降约76.4%。Western blot检测结果显示,Gli1蛋白的表达在转染组中明显低于阴性对照组（P<0.05）。表明Gli1 siRNA序列可以有效干扰Gli1在m RNA及蛋白水平的表达,可用于完成后续试验。2.Gli1 siRNA转染对细胞增殖能力的影响。CCK8检测结果显示:给予Gli1 siRNA转染后24小时后,细胞的增殖效率与NC组相比无明显差别。转染48、72小时后,干扰组细胞的增殖活性明显低于阴性对照组（P<0.05）。3.Gli1 siRNA转染对细胞克隆形成能力的影响。平板克隆实验结果显示:Gli1 siRNA转染组SKOV3细胞克隆形成的数目较阴性对照组明显减少,分别为（13.67±3.50）%和（27.70±1.31）%,差异有统计学意义（P<0.05）。4.Gli1 siRNA对SKOV3细胞迁移及侵袭能力的影响Transwell小室实验结果表明:在迁移及侵袭实验中,Gli1 siRNA转染组穿过小室的细胞数均较阴性对照组明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。5.Gli1 siRNA转染对SKOV3细胞顺铂敏感性影响不同浓度的顺铂作用于Gli1 siRNA转染组及NC组细胞24、48、72小时后结果显示,随着药物浓度的增高,两组细胞的增殖抑制率均上升（P<0.05）。在顺铂作用24小时、48小时及72小时时,Gli1 siRNA转染组与NC组相比,IC50均出现下降,差异有统计学意义（P<0.05）。表明沉默Gli1可增加顺铂的敏感性。6.Gli1 siRNA转染对SKOV3细胞中相关分子表达的影响。qRT-PCR结果显示与阴性对照组相比,Gli1 siRNA转染组的Gli2的基因表达量无明显改变,NANOG基因与MDR1基因的表达量分别为阴性对照组的（75.93±6.06）%和（77.20±7.81）%,差异有统计学意义（P<0.05）。而EMT标记物E-cadherin基因表达出现明显上升,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot检测结果显示Gli2在Gli1 siRNA转染组与阴性对照组蛋白表达量无明显差异（P>0.05）;阴性对照组与Gli1 siRNA转染组NANOG蛋白的相对表达量分别为（0.91±0.03）和（0.077±0.015）,两组MDR1蛋白的相对表达量分别是（0.67±0.03）和（0.35±0.02）,E-Cadherin蛋白的相对表达量为（0.023±0.006）和（0.437±0.015）,差异均有统计学意义（P<0.05）。以上结果说明,沉默Gli1基因表达后,会逆转肿瘤干细胞形成、耐药和上皮间质转化进程。小结:1.Gli1 siRNA可以有效干扰Gli1在m RNA及蛋白水平的表达。2.沉默Gli1基因可抑制肿瘤干细胞标记物NANOG表达,通过Gli1-NANOG途径降低肿瘤细胞“干性”,使细胞增殖、克隆形成及转移能力下降,并且提高顺铂敏感性。3.沉默Gli1基因的表达可抑制上皮性标记物E-cadherin的表达,抑制EMT进程。4.Gli1作为癌基因促进肿瘤的发生、发展,并可能引起卵巢癌对顺铂的耐药。结论:1.Gli与NANOG在EOC组织中表达呈正相关,Gli1、Gli2、NANOG可能为上皮性卵巢癌潜在肿瘤标志物,Gli及NANOG对上皮性卵巢癌患者预后有重要意义。2.Gli参与调控EOC细胞的恶性生物学行为,靶向抑制Gli的表达,可抑制EOC细胞恶性生物学行为,这可能是通过Gli-NANOG途径实现对EOC细胞“干性”的改变。3.在EOC中,可能存在经典与非经典HH信号通路并存现象。Gli在上皮性卵巢癌中表达与临床病理特点及预后存在相关性,Gli可作为上皮性卵巢癌潜在肿瘤标志物。通过调控Gli基因,在一系列体外研究中证实了Gli参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移过程及铂类耐药性,及其内在机制,从而为EOC的诊断、治疗提供了新的思路和策略。