多不饱和脂肪酸(PUFAs)在营养和医学上具有重要作用,目前已成为研究开发的热点。传统PUFAs产品主要来源于鱼油及少数贝类,但对鱼类的过度捕捞已造成严重的资源和环境问题,并且目前PUFAs主要从鱼油中提取,工艺复杂,价格昂贵,因此探索其它途径,开发新的可商业化生产的替代PUFAs资源成为人们关注的焦点,而利用基因工程方法生产PUFAs已成为一种新的有效手段。本实验克隆了PUFAs生物合成途径中的硫脂酶基因、△15和Δ6脂肪酸去饱和酶基因,并构建了花生、蓝藻和大肠杆菌相应的表达载体,进行了遗传转化,主要研究结果如下：1.花生硫脂酶基因的克隆及表达分析(1)以花生栽培品种‘鲁花14’为材料,通过RACE结合生物信息学方法首次克隆了长度为1650bp的花生AhFatA基因cDNA片段,编码372个氨基酸,分子量约为40.96kDa,基因组扩增表明该基因无内含子序列；利用同源克隆方法获得了一个长度为1242bp的AhFatBl基因cDNA片段,编码413个氨基酸,分子量约为45.47kDa,基因组序列全长为2996bp,含有6个外显子和5个内含子。亚细胞定位结果表明,AhFatA、AhFatBl基因编码的蛋白分布于细胞膜、细胞核及细胞质中。基因表达模式分析结果表明,AhFatA基因在种子中表达量最高,在花生果针入土后60天种子中表达量达到最高峰；AhFatBl基因在茎中表达量最高,在花生果针入土第70天种子中表达量达到最高峰。说明硫脂酶基因在花生种子脂肪酸积累和组成上作用明显。为进一步鉴定该基因的功能,构建了CaMV35S和NapinB启动子驱动的AhFatA、AhFatBl基因的正、反义植物表达载体,利用农杆菌介导法将它们导入花生,从过量表达及抑制表达角度验证该基因的功能,目前已获得T1代转基因花生植株,PCR检测结果表明已获得阳性植株,相关验证实验正在进行中。本研究将为花生基因工程改造和研究提供新脂肪酸种质资源和理论基础。(2)构建了GST-AhFatA和GST-AhFatBl融合蛋白的表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,获得67.93kDa和72.44kDa的融合蛋白,将37℃和25℃下培养的菌株收集干燥后进行脂肪酸组成和成分分析,结果表明,AhFatA能有效增加大肠杆菌中C16：1和C18：1含量,而AhFatBl可明显增加大肠杆菌中C14：0、C16：1和C18：1含量。初步证明花生硫脂酶基因有利于增加PUFAs上游底物的合成。(3)分别构建了集胞藻PCC6803psbA2启动子驱动的花生硫脂酶基因同源重组载体,并成功转化集胞藻PCC6803,气相色谱法分析转基因藻中脂肪酸组成和含量,结果表明,在30℃及20℃混养条件下,转花生硫脂酶基因集胞藻中C16：1和C18：0含量均明显提高。2.ω-3生物合成途径脂肪酸去饱和酶基因在集胞藻PCC6803的表达研究(1)克隆集胞藻PCC6803中△15和A6脂肪酸去饱和酶基因,人工合成串珠链孢霉Δ12/Δ15脂肪酸去饱和酶基因和高山被孢酶△6脂肪酸去饱和酶基因。将来源于集胞藻PCC6803的psbA2基因启动子与所获得的脂肪酸去饱和酶基因全编码序列进行重组,共构建10个同源重组质粒并转化集胞藻PCC6803,通过同源序列双交换将重组基因整合到集胞藻PCC6803染色体上以获得相应转基因藻。(2)气相色谱法分析检测转基因集胞藻中脂肪酸组成和含量,结果表明,转脂肪酸去饱和酶基因集胞藻中C18：3n3和C18：4含量明显提高,同时降低了C18：3n6含量,降低了脂肪酸ω6/ω3比例。本实验通过对花生硫酯酶基因、集胞藻PCC6803△15脂肪酸去饱和酶基因、集胞藻PCC6803A6脂肪酸去饱和酶基因、串珠链孢霉△12/A15脂肪酸去饱和酶基因和高山被孢霉△6脂肪酸去饱和酶基因进行转集胞藻PCC6803研究,获得高产PUFAs的转基因藻株,为提高蓝藻中PUFAs含量研究奠定基础,同时为下一步进行大规模生产二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸提供理论依据和实验方案。