禽白血病是由禽白血病病毒（avian leukosis virus,ALV）引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的肿瘤性传染病。ALV是一群具有囊膜的反转录病毒，除了对禽群的直接危害外，还可引起禽群严重的免疫抑制，导致生产力下降，混合感染、继发感染频发。一直以来，由于ALV病毒群的多样性、病毒自身的特殊性以及引起疾病的复杂性，国内外虽进行了大量的研究，但对免疫抑制的机制仍不是很明确。外泌体（Exosomes）的发现，为ALV引起免疫抑制的研究提供了新思路，在ALV与效应细胞间架起了桥梁。著名的“特洛伊木马假说”认为，逆转录病毒利用宿主细胞固有的Exosomes形成和释放途径，利用Exosomes再摄取的途径，形成不依赖于包膜蛋白的感染模式作用于其它细胞。Amy等研究发现在感染人类免疫缺陷病病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）的细胞分泌的Exosomes上，检测到含有HIV的gag蛋白成分。由此，我们推测在ALV感染的细胞分泌的Exosomes上除了gag蛋白外，可能还携带ALV的其他蛋白成分，比如囊膜（env）蛋白（含有ALV的免疫抑制区），携带ALV蛋白成分的Exosomes会对远程细胞产生与ALV相似的免疫抑制作用，即携带ALV蛋白成分的Exosomes会在禽白血病早期造成免疫抑制的微环境，利于ALV在机体内的进一步感染与转移。为研究ALV-J感染细胞分泌的Exosomes(Exo-J)含有ALV-J的某些蛋白成分，并在ALV-J造成的免疫抑制中有重要作用，我们将提取的Exo-J蛋白和正常DF-1细胞分泌的外泌体（Exo）变性后经SDS-PAGE电泳及Western-blot分析，在26KD左右二者的差异条带，将条带切胶后酶解，液相串联质谱分析，结果表明，Exo及Exo-J都含有Exosomes的特征性蛋白，如HSP70、丙酮酸激酶、14-3-3与肌动蛋白等，HSP70蛋白家族常作为Exosomes的标志性蛋白。Exo-J含有ALV-J的env和gag蛋白，ALV gag基因在各亚群间有高度的同源性，gag基因编码的蛋白主要有27KDa、19KDa、15KDa、12KDa，27KDa即是各亚群均共有抗原的gs群特异性抗原。Env蛋白，即env基因编码的病毒囊膜糖基化蛋白，包括跨膜糖蛋白亚单位（TM）和膜表面糖蛋白亚单位（SU）。SU含有病毒-受体决定簇，决定亚群特异性和宿主范围；TM介导病毒与细胞的融合过程。在ALV-J感染细胞分泌的Exosomes中发现病毒结构蛋白的存在，说明Exo-J在ALV-J感染过程可免疫抑制中发挥重要作用。为研究携带了病毒成分的Exo-J具有与ALV-J相似的免疫抑制作用，我们设计了Exosomes对脾脏淋巴细胞增殖作用的体外实验。分离42日龄SPF鸡脾脏白细胞，加入一定剂量的Exosomes共培养适当时间后，通过流式细胞仪检测CD4+、CD8+细胞数量。结果显示，Exo对淋巴没有免疫抑制作用，维持在正常水平；低剂量时，Exo-J促进CD4+、CD8+T细胞增殖，但随着剂量的增加CD4+、CD8+T细胞的数量降低，这也与实际ALV感染机体细胞的情况类似，感染机体/细胞的病毒越多分泌的Exo-J越多，机体的免疫抑制作用越明显。为进一步研究Exo-J与ALV-J是否具有免疫抑制协同作用，设计Exo-J与ALV-J对脾脏淋巴细胞增殖作用的体外实验。在分离得到的脾脏白细胞中加入Exo-J和ALV-J，结果显示，单独加入Exo-J（20μg）、ALV-J实验组，CD4+、CD8+数量明显低于正常对照组，ALV-J组抑制作用更强，但当两者共同作用时，其抑制作用没有增强，反而弱于单一（ALV-J或Exo-J）作用组，与预期结果完全相反，这种现象可能是由于Exo-J和ALV-J在同一体系中竞争性结合相同的细胞受体有关，从而导致免疫抑制能力减弱，这种推测还需要进一步的实验进行验证。有研究表明，Env蛋白与细胞表面特异性受体结合是病毒进入细胞复制。以往的研究也表明，Env蛋白与ALV的免疫抑制密切相关。经质谱分析结果显示，Exo-J中含有ALV-J的Env蛋白，并在Exosomes对淋巴细胞的作用实验中，表现出对免疫细胞（系统）的干扰作用，这可能是Exo-J上携带的Env蛋白发挥的作用，Exo-J起到远程传递的作用，其上含有的env蛋白起到作为配体寻找受体的功能，从而为ALV-J的传播创造相应的微环境。因此，确定病毒免疫抑制作用的基因区域，是未来的研究方向。综上所述，本研究对DF-1细胞分泌Exosomes的提取方法进行了改进，对Exosomes的物理性状及生物学活性进行系统的研究，发现Exo-J携带ALV-J的gag及env蛋白成分，并对免疫细胞具有明显的免疫抑制作用，其在ALV-J的免疫抑制过程中可能发挥决定性作用，而且发现Exo-J与ALV-J在高剂量共同作用免疫细胞时免疫抑制能力相互消弱，这可能是体外实验体系不可能使Exo-J达到远程作用的结果。