Sox基因家族是一类重要的转录因子家族。自从1990年Sinclair等在人类和小鼠中克隆了哺乳动物性别决定基因——睾丸决定因子SRY/Sry(sex-determiningregionofY)基因后,一系列与之同源、编码转录因子的基因相继被发现,统称为Sox基因家族。Sox基因家族是存在于动物个体中的与动物性别决定因子SRY具有高度序列相似性的一类转录因子家族,其特征是含有一个高度保守的与DNA结合相关的高迁移率盒(highmobilitybox,HMG-box)结构域。Sox基因家族广泛参与了生物多种发育过程,在动物性别决定与分化、生殖腺发育、早期胚胎发育、神经系统发育、软骨发生及血管发生等多种组织器官的形成过程中发挥着重要的生物学作用。　　 家蚕是鳞翅目昆虫的典型代表,是一类重要的经济昆虫,也是良好的模式生物,但家蚕Sox基因的研究还处于起步阶段。Dichaete基因属于Sox基因家族B亚族基因,首先在黑腹果蝇中被发现,与哺乳动物中的Sox2同源性最高,自发现以来即受到广泛的关注。该基因也是作为一种转录因子参与个体发育特别是个体神经系统发育的调控,它还参与了个体后肠发育、卵母细胞形成等多种发育过程。　　 本文基于其他模式生物的先进研究成果及家蚕基因组信息,分析并克隆了果蝇Dichaete基因的家蚕同源基因BmDichaete基因,并对其表达及功能进行了研究,得到了如下研究结果。　　 1,家蚕BmDichaete基因的克隆及序列分析　　 利用家蚕EST数据电子克隆了果蝇DmDichaete基因在家蚕中的同源体,定位于第四号染色体nscarf2589上,命名为BmDichaete。通过Race技术成功克隆了家蚕BmDichaete基因完整的cDNA序列,全长为1541bp,其ORF长741bp(ORF:112-852),编码246个氨基酸,预测蛋白的分子量大小为27.3kDa,等电点为9.89。通过结构域预测,编码蛋白的第39个氨基酸到第107个氨基酸之间,有一个Sox基因家族的保守结构域HMG-box。基因组序列分析结果显示BmDichaete基因完整的ORF即为一个外显子,不含有内含子结构,这也同Sox基因家族B亚族基因的特点相吻合。同源性分析结果表明,BmDichaete基因在进化上高度保守,与其脊椎动物及非脊椎动物中的同源基因在HMG-box结构域内高度保守(≥90%),在HMG-box区外也有一定的序列相似性;家蚕中Sox基因成员之间在HMG-box区保守性约为50%,HMG-box区外基本无序列相似性。　　 2,家蚕BmDichaete基因的原核表达　　 由于BmDichaete基因与亚族内的其它基因相比,它们在HMG-box区的序列相似性达到了90%以上,为了研究方便,实验中我们表达了两段BmDichaete基因的片段。根据BmDichaete基因的完整cDNA序列设计引物,体外克隆BmDichaete基因的ORF及不含有保守结构域HMG-box的特异序列。将目的片段序列亚克隆到pET-28a-c(+)表达载体,构建重组表达质粒,将该重组质粒转化到BL21表达宿主菌中,用IPTG诱导BmDichaete-pET-28a-c(+)/BL21表达目的蛋白。由于加了组氨酸标签,目的蛋白大小分别为32.3kD租17kD,与预测结果一致。该蛋白以包涵体的形式存在。IPTG浓度和诱导时间对BmDichaete蛋白的表达影响不大,但诱导温度会显著影响目的蛋白的表达量。本实验最终采用0.4mMIPTG、37℃诱导5h来诱导目的蛋白的表达。　　 3,家蚕BmDichacte蛋白抗体的制备　　 以纯化的BmDichaetc特异片段蛋白为抗原制备了抗体,并用饱和硫酸铵盐析法纯化,通过间接ELISA法检测抗体效价为1:100000。　　 4,家蚕BmDichaete基因的表达模式分析　　 提取家蚕发育各时期和幼虫5龄3天各组织总RNA,利用RT-PCR技术分析BmDichaete基因在家蚕发育过程中的表达模式。研究发现BmDichaete在家蚕整个发育过程中都有表达,蛹后期表达量降低,化蛾时基本不表达:BmDichaete基因在家蚕幼虫期的表达还具有组织特异性,主要在神经、头部、卵巢、后肠及丝腺中表达。　　 提取家蚕胚胎发育各天的蛋白进行westernblotting分析,发现BmDichaete基因在家蚕胚胎发育时期持续的表达。　　 5,家蚕胚胎发育时期的RNAi　　 通过dsRNA介导的RNAi技术,对家蚕大造品种的胚胎进行BmDichaete基因沉默。通过统计显微注射后蚕卵的转青率及孵化率,同时通过石蜡切片观察胚胎的内部结构。结果显示,干涉后的蚕卵其发育情况跟正常组无明显差别。