目的：　　 p21活化激酶(p-21 activated kinases,PAKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,为Rho家族小鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42/Rac1、生长因子信号的下游主要靶蛋白,参与细胞内多个信号转导通路,发挥调节细胞骨架重组、细胞周期、基因转录及胚胎发育等多种生命活动,并在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。迄今为止PAK家族共发现6个成员,根据其结构和功能的相似性,将它们分为两类,Ⅰ类包括PAK1-3,Ⅱ类包括PAK4-6。　　 其中,PAK4是Ⅱ类PAK的代表,与胚胎发育和肿瘤的发生发展密切相关,有望成为癌症诊断和治疗的一个重要靶点。我们课题组多年来一直致力于探索PAK4新的相互作用蛋白和底物,同时研究其作用机制和功能。目前我们利用酵母双杂交的技术,已经成功筛选到了数个PAK4新的作用蛋白,并对其展开了研究。　　 β-catenin是我们发现的PAK4新的作用蛋白,同时作为经典的Wnt信号通路的一个关键蛋白。经典的Wnt信号通路是调控细胞生长增殖的关键途径,在胚胎发育和肿瘤发生发展中起着重要作用。近年的研究表明,经典的Wnt/β-catenin通路的异常活化是结肠癌和肝癌等多种癌症的重要标志。　　 不同信号通路之间的交叉对话,引起协同或拮抗作用,最终产生不同的生物学效应。目前关于Wnt和PAK信号通路交叉对话的研究才刚刚起步。我们的研究是从探讨PAK4核浆穿梭的机制入手,并对PAK4与β-catenin的关系进行深入的探讨,阐明PAK4在Wnt/β-catenin信号通路中扮演的角色,并为肿瘤的诊断和治疗提供新的研究方向。　　 肿瘤转移相关基因(metastasis-associated gene1,MTA1)是我们发现的另一PAK4的新的相互作用蛋白。MTA基因家族是一类重要的肿瘤转移相关基因,它们主要参与组成具有核小体重塑活性的组蛋白去乙酰基酶(nucleosome-remodellinghistione deacetylase,NuRD)复合体,发挥其基因转录抑制作用,并通过调节雌激素通路、细胞骨架和细胞凋亡等途径促进肿瘤的侵袭和转移。最近的报道表明,缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor1α,HIF-1α)是MTA1的一个新的重要靶向基因,在缺氧条件下乳腺癌细胞的MTA1表达升高,进一步增加了HIF-1α的稳定性和转录活性。在胃癌中,MTA1和HIF-1α都是重要的肿瘤转移促进因子。其中MTA1与胃癌的恶性程度密切相关,而HIF-1α在胃癌中参与多种信号转导途径,与多种癌基因和抑癌基因相互作用,如P53和VHL(von Hippel Lindau)等,共同影响胃癌的侵袭和转移。　　 我们的研究旨在探索在胃癌细胞中PAK4与MTA1的相互作用对HIF-1α信号通路的调控机制,为胃癌的治疗提供新的靶点。　　 方法：　　 一、PAK4的核浆穿梭调控β-catenin的定位和信号转导　　 1、利用Confocal和Western blot证实PAK4是一种核浆穿梭蛋白,并且PAK4的出核由CRM-1介导。　　 2、利用Confocal和定点突变等方法鉴定PAK4的核输出信号和核定位信号。　　 3、利用GST-pull down和免疫共沉淀证实PAK4的入核由importinα5介导,且二者的结合依赖cNLS1和cNLS3。　　 4、GST-pull down和免疫共沉淀证实PAK4与β-catenin二者在体内外相互作用。　　 5、体外激酶实验探测PAK4是否磷酸化β-catenin。　　 6、利用Dual-Luciferase Assay System分析PAK4的激酶活性和核浆定位是否影响β-catenin依赖的TCF/LEF的转录活性。　　 7、Real-time PCR方法检测PAK4的核浆定位对β-catenin下游靶基因的影响。　　 8、利用染色质免疫沉淀法确定PAK4与TOP-luc是否结合。　　 二、PAK4与MTAl的相互作用正性调节胃癌细胞HIF-1α信号通路　　 1、利用GST-pull down和免疫共沉淀证实PAK4、MTA1与HIF-1α三者相互作用。　　 2、利用RNAi干涉抑制PAK4的表达后,通过Western blot方法检测其对MTA1和HIF-1α表达的影响。　　 3、Real-time PCR方法检测PAK4是否影响HIF-1α下游基因的表达。　　 4、利用Dual-Luciferase Assay System分析PAK4对HIT-1α下游的HRE反应元件转录活性的影响。　　 5、利用Confocal探测在胃癌细胞中缺氧对PAK4定位的影响。　　 6、利用Western blot分析在胃癌细胞中缺氧对PAK4的表达的影响。　　 结果：　　 一、PAK4的核浆穿梭调控β-catenin的定位和信号转导　　 1、PAK4是一种核浆穿梭蛋白,并且PAK4的出核由CRM-1介导。　　 2、PAK4包含三个核输出信号(NESs),即cNES1、cNES2和cNES3,其中cNES1的活性最强,位于82-94位氨基酸。　　 3、PAK4包含两个核定位信号(NLSs),其中cNLS1是强核定位信号,cNLS3是弱核定位信号。　　 4、PAK4入核由importinα5介导,且二者的相互结合依赖于cNLS1和cNLS3。　　 5、PAK4与β-catenin相互作用并磷酸化β-catenin Ser675位点。　　 7、PAK4磷酸化β-catenin抑制其降解,并增加β-catenin下游TCF/LEF依赖的转录活性。　　 8、PAK4的入核促进了β-catenin的入核和表达。　　 9、核内的PAK4调控β-catenin依赖的信号转导。　　 二、PAK4与MTA1的相互作用正性调节胃癌细胞HIF-1α信号通路　　 1、PAK4与MTA1相互作用,并确定其作用区域。　　 2、PAK4与HIF-1α直接相互作用,且在缺氧条件下胃癌细胞中PAK4、MTA1与HIF-1α三者形成复合体。　　 3、在胃癌细胞中PAK4、MTA1和HIF-1α三者形成正反馈。　　 4、PAK4与MTA1共同调控HIF-1α的信号通路。　　 5、缺氧促进胃癌细胞中PAK4的进核。　　 6、缺氧促进胃癌细胞中PAK4的表达。　　 结论：　　 一、PAK4的核浆穿梭调控β-catenin的定位和信号转导　　 1、PAK4是一种核浆穿梭蛋白,并且PAK4的出核由CRM-1介导,入核由importinα5介导,且二者的相互结合依赖于cNLS1和cNLS3。　　 2、PAK4与β-catenin相互作用,并磷酸化β-catenin的Ser675位点。　　 3、PAK4磷酸化β-catenin抑制其降解并促进β-catenin下游TCF/LEF的转录活性。　　 4、PAK4的入核促进了β-catenin的入核并调控β-catenin依赖的信号转导。　　 二、PAK4与UTA1的相互作用正性调节胃癌细胞HIF-1α信号通路　　 1、在缺氧条件下,PAK4、MTA1与HIF-1α三者形成复合体。　　 2、在胃癌细胞中,PAK4与MTA1共同调控HIF-1α的信号通路。　　 3、在胃癌细胞中缺氧促进PAK4的进核和表达。