鸡B淋巴细胞激活因子基因的克隆表达及生物学功能研究

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根据已报道的BAFF的开放阅读框架(ORF)序列设计特异性引物,以鸡的法氏囊淋巴细胞的总RNA为模板进行RT-PCR。将PCR回收产物与克隆载体pGEM-T连接,并转化E.coli DH5α,取阳性克隆进行测序分析。克隆的BAFF序列测序结果表明,其序列全长为867bp,将所克隆的序列与已报道的序列相比较,二者核苷酸序列的相似性为99.88%(866/867),表明成功克隆获得了鸡淋巴细胞激活因子基因的ORF。DNAssist分析表明,所克隆基因编码的蛋白质分子量为31.6kDa,等电点为8.3。设计引物,以E.coli DH5α(pGEM-T-BAFF)为模板克隆BAFF的ORF,与质粒载体pMAL-c2X连接。连接产物转化宿主细菌E.coli Rosset(DE3),再进行PCR和酶切鉴定及测序鉴定。将阳性转化菌落进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析显示所表达融合蛋白的分子量约为74kDa,获得了可溶性BAFF融合蛋白。表达的融合蛋白约占总蛋白含量的15%。通过MTT法检测纯化的融合蛋白活性,结果显示BAFF融和蛋白可以明显促进脾脏淋巴细胞的增殖。将纯化的BAFF融合蛋白注射鸡,检测纯化的重组蛋白的生物特性,结果显示BAFF组的脾脏较对照组的增重明显,而BAFF重组蛋白对法氏囊病疫苗引起的病理变化保护不明显。本实验首次在国内克隆出鸡的BAFF基因,表达出了可溶性的BAFF重组蛋白,通过分析外源BAFF生物学功能,结果显示重组蛋白能在一定程度上提高鸡的免疫功能。
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