第一章高血压患者群体中Corin基因型分析及功能研究研究目的:高血压是一种常见的慢性病,具体发病的分子病理机制至今仍不完全清楚,目前普遍认为在高血压的发病过程中,基因变异起到重要作用。Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶corin高表达于心肌细胞中,其主要功能是将心房利钠肽前体(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)活化为有生物学活性的心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP),参与机体水钠平衡、血压和血容量的调节。据报道CORIN基因变异体T555I/Q568P与北美黑人多发的心肌肥厚和高血压疾病有密切关联;在先兆子痫患者中发现的CORIN基因变异体K317E和S472G显著降低corin功能;又有报道显示,在心衰、冠心病、心肌梗死和中风患者中,血浆可溶性corin水平显著低于正常人,提示corin的功能缺陷可能会参与高血压等心血管疾病的发生发展中。在本章的研究中,我们对正常人和高血压患者中CORIN基因变异体进行测序筛查,并进一步检测这些基因变异是否影响corin的表达活化与功能,探究corin在高血压发病过程中的作用及机制。研究方法:1.收集正常人和高血压患者的外周血样本,离心获得血浆和血细胞。用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定血浆中可溶性 corin、氨基端心房利钠肽前体(N-terminal-pro-ANP,NT-pro-ANP)、氨基端B型利钠肽前体(N-terminal-pro-B type natriuretic peptide,NT-pro-BNP)的水平。2.提取血细胞中的基因组DNA,作为聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的模板,扩增CORIN基因的22个外显子并对所得产物进行测序。3.对新发现的CORIN基因变异体再次PCR并测序验证,随后以野生型(wild-type,WT)corin质粒为模板,运用基因定点突变法构建相应突变体质粒。4.将野生型和突变体corin质粒转染人胚肾上皮细胞(human embryonic kidney,HEK)293细胞,用含有pro-ANP的上清孵育转染后的细胞,收集上清并制备细胞裂解液。随即,用免疫沉淀法(immunoprecipitation,IP)、蛋白印迹法(Western blotting)检测corin蛋白的表达、活化情况,以及corin活化pro-ANP的情况,研究各个突变体对corin表达、活化与功能的影响。5.将corin野生型和显著影响corin表达、活化与功能的突变体质粒R530S、T924M转染HEK293细胞后,用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测这些突变体是否影响corin在细胞表面的表达。6.野生型和R530S、T924M质粒转染HEK293细胞后,收集12、16、24、36、48小时(hour,h)的上清和细胞,用ELISA检测各时间点的上清和细胞裂解中的可溶性corin含量。并用Western blotting检测24 h上清和细胞裂解中的corin含量。7.野生型和突变体R530S、T924M质粒转染HEK293细胞后,进行免疫荧光染色(immunofluorescent staining),在共聚焦显微镜(confocal microscopy)下观察突变体是否影响corin蛋白在细胞内的亚定位情况。8.构建corin野生型和突变体R530S、T924M的分子模型,判断突变体分子结构的改变情况。9.前体蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶 6(proprotein convertase subtilisin/kexin-6,PCSK6)可在细胞表面将corin活化,为了研究野生型和突变体R530S、T924M corin在过表达PCSK6时的表达与活化情况,将野生型和突变体质粒与PCSK6质粒共同转染HEK293细胞,收集上清和裂解液,检测corin在细胞膜上被PCSK6活化的情况,验证突变体对corin表达与活化的影响。10.野生型corin和R530S质粒以1:1的比例共同转染HEK293细胞后,收集细胞裂解液,Western blotting检测R530S对野生型corin表达与活化的影响。研究结果:1.我们在中国人群中发现并定义了 9个CORIN基因变异体:insA、Y13C、D95Y、L334W、R349H、R525H、R530S、P866S 和 T924M。其中变异体 insA 的相关研究结果,在本人的硕士毕业论文《心脏酶corin在高血压发病机制中的作用》中已有阐述,并发表于Sci Rep.2014;4:7378。2.变异体Y13C、D95Y、L334W、R525H在高血压患者和正常人群体中出现的频率没有显著差异(所有P值都大于0.05)。突变体R349H、P866S、T924M只在高血压患者群体中发现。R530S在高血压患者和正常人群体中均有发现,但在高血压患者群体中出现的频率显著高于正常人群体(p=0.023),这一结果在另一个独立群体样本分析中得到了验证。3.功能实验中发现,C13Y、D95Y、L334W、R349H、R525H、P866S 并不影响corin活化pro-ANP的能力,也不影响corin的表达与活化。变异体R530S和T924M并不影响corin的表达,但是显著降低corin活化pro-ANP的能力(p<0.001 vs.WT),分别只有 WT 活性的 39.9 ± 15.0%和 39.7 ± 13.6%。4.在酶原活化实验中发现,R530S和T924M不影响corin蛋白的表达,但R530S和T924M的～40kDa活化带的量只有21.5± 1.1%和18.5±0.9%,显著低于WT(39.9 ± 1.7%,p<0.001),说明 R530S 和 T924M 显著减少 corin 的酶原活化,进而影响其活化pro-ANP的功能。5.流式细胞术检测到WT在细胞膜上的阳性率为41.8 ± 2.3%,R530S的阳性率为20.4 ± 1.9%,显著低于WT(p<0.001)。而T924M的阳性率为37.8 ± 2.9%,与WT相比,没有显著差异。表明R530S显著影响了 corin蛋白在细胞表面的表达,而T924M则无显著影响。6.ELISA检测到细胞上清中,R530S和T924M corin蛋白显著低于WT(p<0.01),而细胞裂解中的corin蛋白含量,三者之间没有显著差异。Western blotting检测上清中的corin蛋白,发现WT可以产生～180、～160、～100 kDa三条片段,R530S的三条带总量显著少于WT,分别统计～180、～160、～100 kDa条带的含量,也都显著少于WT。而T924M的三条带总量显著少于WT,分别统计三条带发现,～180 kDa条带的含量与WT没有显著差异,～160、～100 kDa的含量显著少于WT。7.免疫荧光实验发现,锚定到细胞膜上的R530S corin蛋白显著少于WT,一部分R530S corin蛋白滞留在内质网中,提示R530S corin蛋白合成与转运过程中,在内质网中受阻。而T924M corin蛋白的亚细胞定位与WT相比,没有显著差异。8.构建分子结构模型的研究发现,位于corin分子结构第二个卷曲结构域中的变异体R530S,可能导致该结构域的结构不稳定,引起corin蛋白错误折叠,使corin蛋白滞留在内质网中;位于蛋白酶区结构域的变异体T924M,导致corin酶原激活位点R801附近的表面环(surface loop)结构改变,阻碍了 corin酶原的激活。9.当过表达PCSK6时,WT和T924M的活化带含量都显著高于未过表达PCSK6的对照组,而R530S的活化带含量与未过表达PCSK6的相比没有显著差异。提示R530S corin蛋白有一部分滞留在细胞内,而T924M corin蛋白能正常在细胞表面表达。10.WT与R530S共转染实验发现,单独转染WT和R530S的实验组,corin活化带的量分别为42.1 ± 1.3%和23.3 ± 1.9%,而当WT和R530S共转染时,活化带的量为32.4 ±1.9%,显著低于WT。说明R530S对WT corin的活化有显著的抑制作用。11.11个含有R530S等位基因的个体,血浆可溶性corin水平为0.59 ± 0.05 ng/mL,显著低于264个正常人(0.86±0.03ng/mL,p=0.002),但与391个不含R530S等位基因的高血压患者没有显著差异(0.62±0.1 ng/mL,p=0.618)。含R530S等位基因的个体,血浆中可溶性NT-pro-ANP水平显著高于正常人(2.06 ±0.27 vs.0.85 ± 0.16 nmol/L,p=0.001),而可溶性NT-pro-BNP的水平则没有显著差异(27.67± 9.59 vs.34.1 ± 9.11 pg/mL,p=0.652)。结论:本章的研究中,我们在高血压患者和正常人群中筛查到并定义了 9种CORIN基因变异体,除我们先前报道的变异体insA之外,其余8个都是首次报道,其中变异体Y13C、D95Y、L334W和R525H在正常人群和高血压患者群体中出现的频率没有显著差异,变异体R349H、P866S、T924M只在高血压患者群体中发现,变异体R530S在高血压患者群体中出现的频率显著高于其在正常人群中出现的频率。通过功能和细胞学实验发现,变异体R530S导致corin蛋白在内质网中滞留,最终降低corin的活化与功能;变异体T924M阻碍corin蛋白在细胞膜上被PCSK6活化的过程,导致corin功能缺陷。我们的结果提示,影响corin功能的基因变异在人群当中并不罕见,一些变异体可能通过引起corin功能缺陷而参与高血压的发病过程中。对这些基因变异体的进一步研究,还有助于我们深入了解corin蛋白合成与活化的调控机制。第二章Corin蛋白胞质尾部的胞内滞留信号研究研究目的:Corin在细胞内以酶原形式合成,经内质网、高尔基体逐级修饰、包装、折叠后,最终锚定到细胞膜上,才能被PCSK6切割活化。胞内转运与质膜锚定过程,对于corin正常生物学活性的发挥至关重要。我们前期研究中发现,人CORIN基因变异体insA导致corin蛋白胞质尾部变短,使corin蛋白滞留在内质网中,引起corin功能缺陷,可能参与高血压的发生发展。我们实验室还发现小鼠corin胞质尾部截短到只有14个氨基酸残基时(mD99),corin在细胞表面的表达量显著增加。这些研究结果提示,corin胞质尾部可能在胞内转运与质膜锚定过程中起重要作用。本章的研究旨在探讨corin胞质尾部序列与corin蛋白胞内转运与质膜锚定的关系,有助于我们进一步了解corin胞质尾部对corin正常生物学活性的发挥有着什么样的作用。研究方法:1.人CORIN基因变异体insA和小鼠Corin基因变异体mD99的胞质尾部氨基酸序列具有极高的同源性,分别为:insA:M-G-N-G-C-S-Q-K-L-A-T-A-N-L-L-R-mD99:M-G-C-P-Q-K-L-V-T-A-N-L-L-R-将二者进行比对发现,insA的胞质尾部比mD99多了两个氨基酸残基:甘氨酸(Glycerine,G)和天冬酰胺(asparagine,N)。此外,insA胞质尾部序列中的第六位丝氨酸残基(serine-6,S-6)和第十位的丙氨酸残基(alanine-10,A-10)与mD99胞质尾部序列中相对应位置的第四位脯氨酸残基(proline-4,P-4)和第八位缬氨酸残基(valine-8,V-8)是不同的。分别以insA、mD99为模板,用基因定点突变法构建突变体insAAGN(insA胞质尾部删除GN序列)、mD99GN(mD99氨基末端加上GN序列)、mD99-SA(mD99胞质尾部的氨基酸残基P-4和V-8分别置换为S-4和A-8)。2.将野生型及突变体质粒转染HEK293细胞,用Western blotting方法检测corin蛋白的表达与活化。3.将野生型及突变体质粒转染HEK293细胞,用流式细胞术方法检测corin蛋白在细胞表面的表达情况。4.用放线菌酮(cycloheximide)处理转染了野生型及突变体质粒的HEK293细胞,阻断细胞内corin蛋白的合成,处理0、4、6、8、10、12小时(hour,h)之后,收集细胞并制备细胞裂解液,用Western blotting方法检测细胞中corin蛋白的量。5.对转染了野生型和突变体质粒的HEK293进行免疫荧光染色,在共聚焦显微镜下观察corin蛋白的亚细胞定位情况。6.Corin在内质网和高尔基体中经过N-连接糖基化修饰,Western blotting可检测到细胞中corin蛋白有a、b、c三条不同分子量大小的条带。糖苷内切酶H(endoglycosidaseH,EndoH)可水解消化内质网与早期高尔基体中的N-连接多糖链,无法水解经晚期高尔基体修饰后N-连接多糖链。用Endo H处理corin蛋白,检测a、b、c三条带分子量大小的变化,研究corin蛋白上多糖链的水解情况,用以研究corin蛋白在细胞内的亚定位。研究结果:1.Corin表达与酶原激活实验中,发现人野生型corin(hWT)活化带含量为47.7 ± 1.7%,insA 的活化带含量为 27.7 ± 1.7%,显著低于 hWT(p<0.01,n=6),将insA胞质尾部的GN序列删除之后,insAAGN的活化带含量显著高于insA(38.6±3.3%vs.27.7±1.7%,p<0.01,n=6),而与hWT相比没有显著差异。小鼠野生型corin(mWT)和mD99的活化带含量分别为42.8 ± 2.5%和59.8 ± 2.9%,二者差异显著(p<0.01,n=6),将mD99胞质尾部加上GN序列之后,mD99GN的活化带含量为44.0±4.1%,显著低于mD99(p<0.0l.n=6),与mWT相比没有显著差异。结果提示corin胞质尾部的GN序列可能作为一个motif,发挥胞内滞留信号的作用。2.将mD99胞质尾部序列中的P-4和V-8置换为S-4和A-8(mD99-SA)之后,Western blotting检测到mD99-SA corin活化带的含量显著高于mWT,与mD99相比没有显著差异,提示这两个位点上的氨基酸残基,在corin蛋白的胞内转运与质膜锚定过程中并无重要作用。3.流式细胞术检测到hWT、insA在细胞表面的corin阳性率分别为67.4 ± 2.9%和43.3±4.9%,二者差异显著(p<0.05,n=3),将insA胞质尾部的GN序列删除之后,insA△GN 的阳性率为 63.7±4.3%,显著高于 insA(p<0.05,n=3),与 hWT相比没有显著差异。mWT、mD99的阳性率分别为44.6±9.9%和67.1±11.0%,二者差异显著(p<0.05,n=3),将mD99胞质尾部加上GN序列之后,mD99GN的阳性率为48.6±12.4%,显著低于mD99(p<0.05,n=3),与mWT相比没有显著差异。结果支持GN motif可能是corin胞质尾部的一个胞内滞留信号,降低corin蛋白在细胞表面的表达量。4.放线菌酮处理转染了 corin质粒的细胞,发现细胞内insA corin蛋白的减少速率显著慢于hWT(p<0.01,n=4),insA△GN的减少速率与hWT相比,没有显著差异。mD99的减少速率显著快于mWT(p<0.01,n=4),mD99GN与mWT相比,没有显著差异。对细胞内corin蛋白的半衰期(halftime)进行统计分析发现,hWT、insA的半衰期分别为8.0±0.2h和11.9±0.5 h,二者差异显著(p<0.001,n=4);insAAGN的半衰期为7.5 ± 0.2 h,与hWT相比没有显著差异。mWT、mD99的半衰期分别为9.3 ± 0.3 h和5.9 ± 0.2 h,二者差异显著(p<0.001,n=4);mD99GN的半衰期为9.0 ± 0.2 h,与mWT相比没有显著差异。结果进一步支持corin胞质尾部的GN motif是一个胞内滞留信号。5.免疫荧光染色发现insA corin蛋白大部分滞留在高尔基体中,insA△GN在高尔基体中的亚定位与hWT相比没有显著差异,均不在高尔基体中有明显滞留。mWT在高尔基体中有部分滞留,mD99则没有明显滞留,mD99GNcorin在高尔基体中亚定位与mWT相比没有显著差异。结果提示,GN motif可发挥胞内滞留信号的作用,将corin蛋白滞留在高尔基体中。6.Endo H处理野生型与各突变体corin蛋白,Western blotting均可以检测到三个条带a、b和c。条带a是经过晚期高尔基体修饰后的corin蛋白,条带b、c是位于内质网和早期高尔基体中的corin蛋白。实验发现条带a分子量大小均不变,条带b、c分子量均变小,没有显著差异。结果提示GN motif导致corin蛋白在早期高尔基体中滞留,从而影响蛋白的胞内转运和质膜锚定。结论:本章研究中,我们以第一章中,在高血压患者群体中发现并定义的人CORIN基因变异体insA为切入点,对corin胞质尾部在corin蛋白的胞内转运和质膜锚定过程中的作用进行了研究。结果显示,corin胞质尾部的GN motif可发挥胞内滞留信号的作用,导致corin蛋白在早期高尔基体中滞留,最终降低corin的活化与功能。对corin胞质尾部滞留信号的进一步研究,有助于我们加深对corin在细胞中的生物合成、转运及活化调控机制的了解。