马铃薯E3泛素StPUB17靶标StKH17在晚疫病抗性中的功能研究

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马铃薯(Solanum tuberosum L.)是中国第四大粮食作物,生产过程中会受到多种病虫害的危害,严重影响其产量和品质。其中由卵菌致病疫霉菌(Phytophthora infestans(Mont.)De Bary.)引起的晚疫病是危害最严重的病害。本实验室前期发现马铃薯U-box类E3泛素连接酶StPUB17可以正调控晚疫病的抗性。通过酵母筛库得到一个互作蛋白为StKH17,是一个含有KH-domain的RNA结合蛋白,在本氏烟中初步鉴定是一个抗性负调控因子。本研究旨在通过遗传转化获得超量和干涉StKH17马铃薯转基因植株,验证其在晚疫病抗性中的功能;以StKH17为诱饵通过酵母双杂交筛库筛选与其互作的靶标蛋白;获得稳定表达StKH17和myc融合蛋白转基因株系,为下一步利用Chip-seq技术研究StKH17调控的RNA靶标打下基础。取得的主要研究结果如下:1、构建了StKH17超量表达和RNAi干涉载体,通过遗传转化成功获得了2个超量表达和6个干涉马铃薯株系;晚疫病菌接种鉴定表明,超量表达StKH17降低晚疫病抗性,而干涉StKH17增强晚疫病抗性,即StKH17负调控马铃薯晚疫病的抗性。2、蛋白结构分析表明StKH17具有2个保守的结构域,一个为STAR-domain,另一个为KH-domain。酵母自激活和点对点互作验证表明,StKH17与StPUB17的互作需要STAR-domain,缺失STAR-domain对于酵母自激活效应没有影响;而KH-domain对于酵母自激活效应很重要,但其缺失对于StKH17与StPUB17的互作没有影响。3、以StKH17△128-261为诱饵从酵母文库中筛选到3个候选互作蛋白,一个为StKH17自身,另一个为StKH17-2,还有一个为StKH17-3,酵母点对点互作验证表明StKH17-2和StKH17-3与StKH17△128-261特异互作,而不与StPUB17互作。4、构建了破坏RNA结合能力的StKH17(GDDG)突变体载体,在本氏烟中瞬时表达时,发现其不能促进晚疫病菌的侵染。表明GDDG domain对StKH17发挥功能十分重要。5、构建了StKH17-myc蛋白标签载体并通过马铃薯遗传转化,获得11个转基因株系,Western Blot检测到了3个株系稳定的表达了StKH17和3×myc融合蛋白。本研究初步回答了StPUB17可能是通过降解负调控感病因子StKH17从而实现正调控马铃薯晚疫病抗性的假设。另外本研究结果表明,StKH17可能以复合体的形式调控抗病防卫相关基因的可变剪接从而发挥负调控晚疫病抗性的功能。本研究为构建StPUB17-StKH17-靶标蛋白互作模型,阐明StPUB17在马铃薯晚疫病抗性中的功能和分子机制奠定了良好基础。
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