烟草角斑病菌全基因组序列分析及其生防制剂的应用

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 7次 | 上传用户:wstpxx
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烟草角斑病近年在东北烟区呈上升趋势,是烟叶生长后期的重要病害,对烟叶的产量及品质有严重影响。本文从阜新地区具有明显角斑病症状的烟草叶片上分离纯化出病原菌,通过培养性状、形态学观察、致病性测定及生理生化性质等研究,经分子生物学鉴定,明确病原菌为Pseudomonas syringae pv.tabaci,阜新(FX)分离株,对FX菌株进行了全基因组测序分析。此外,进行了生物杀菌剂筛选及田间防治应用研究。本研究取得的主要结果如下:1.在辽宁省阜新地区,采集具有明显烟草角斑病症状的感病叶片,组织分离法分离纯化得到菌株FX,与标准菌株烟草角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci 216)和烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci DN)比对。分离出的菌株FX经柯赫氏法则回接烟草叶片,病斑呈不规则多边形,边缘受叶脉限制,与对照菌株216接种后产生的症状一致,为典型的烟草角斑病;病原菌经电镜观察菌体大小约为0.50.7×1.52.0μm,端生鞭毛1根;经葡萄糖、乳糖、蔗糖、硝酸盐还原、精氨酸脱羧酶、淀粉、明胶等生理生化试验结果表明,供试菌株与对照菌株216反应结果一致;对菌株FX进行基因组DNA提取及浓度测定,分别使用通用性引物1612JF/2591JR和角斑病菌特异性引物2F2/2R2对得到的基因组DNA进行PCR扩增,结果表明该菌株FX为角斑病菌。2.对烟草角斑病菌FX菌株进行了全基因组测序:二代测序结果高质量reads的总数为152,166条,高质量reads碱基总数为1,892,123,741 bp。经三代测序组装后,拼接的基因组序列的长度为4,756,717 bp,GC含量百分比为55.14%;预测编码基因4328个,序列长度为4,106,799 bp;重复序列长度占总基因序列长度的0.26%;非编码RNA分为t RNA和rRNA两大类别;该菌株的核基因组中共发现CRISPR 12个;基因岛预测共发现15个基因岛;该菌株中预测含有4个前噬菌体;毒力因子数据库分析共发现692个毒力基因;碳水化合物相关酶的类基因共有147个;预测得到的基因蛋白序列与转运蛋白共444条;病原体-宿主互作因子在此预测中有912个基因;抗生素抗性基因4个;含有信号肽蛋白预测显示,菌株的基因组序列中有416个蛋白;跨膜螺旋结构的蛋白显示出1040个编码蛋白质的基因;含有信号肽的蛋白中除去含有跨膜螺旋的蛋白,剩余的分泌蛋白共有331个。利用预测得到的基因序列与3475个COG功能基因、3200个GO基因、2738条KEGG通路、3619条Swiss-Pro等基因信息进行注释,构建FX菌株的细菌完成图,基因组大小为4,106,799 bp。本研究将测得的Pseudomonas syringae pv.tabaci FX菌株与已经登陆在NCBI上的四川越西地区的烟草野火病菌Pseudomonas syringae pv.tabaci yuexi-1进行全基因组特性毒力因子的比较,Pseudomonas syringae pv.tabaci yuexi-1菌株序列号为JWJF00000000。差异因子共有423个,如hptA、ptxR、rtxD、rfaE、htpB、IcmF1、clp V、farB、mtr D等。3.通过室内平板扩散法,将枯草芽孢杆菌、木霉生防制剂、6%春雷霉素、3%中生菌素、1.8%嘧肽·多抗等7种生物杀菌剂对病原菌的抑制率进行测定:抑制效果依次为1.8%嘧肽·多抗>3%中生菌素>6%春雷霉素>HBL>枯草芽孢杆菌>10%井冈霉素>木霉生防菌剂;烟草田间试验结果表明,防治效果最佳的则是6%春雷霉素和1.8%嘧肽·多抗,防效分别达到61.47%和59.10%。
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