路路通为金缕梅科枫香树Liquidambar formosana Hance的干燥成熟果实，具有祛风除湿、疏肝活络、利水通经等功效，常用于关节痹痛，麻木拘挛，水肿胀满，乳少经闭等症。路路通含有丰富的三萜类化合物，其中羽扇豆烷型化合物路路通酸为其主要成分。目前三萜的抗肿瘤作用备受研究者关注。　　研究目标:发现路路通抗肿瘤成分，研究抗肿瘤效果、增强活性方法及抗肿瘤作用机制。　　方法与结果:针对路路通的研究现状开展了以下几个方面的研究工作。　　1、活性导向分离　　1)以抗肿瘤作用为活性导向，对路路通的抗肿瘤活性部位进行了活性追踪，采用MTS法，对路路通的石油醚提取部位、二氯甲烷提取部位和甲醇提取部位抗肿瘤作用进行了筛选，结果表明，在100μg/mL浓度下，路路通的二氯甲烷提取部位对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长抑制率达92.7％，其IC50值为47.9μg/mL。　　2)以抗肿瘤活性最强的二氯甲烷提取部位为研究对象，采用多种色谱层析技术，对其中所含化学成分进行了系统的分离和纯化，从该部位中分离得到路路通酸、羽扇烯酮、白桦脂酸、白桦脂醇、熊果酸、3-表熊果酸、齐墩果酮酸、3氧代-12烯-28乌苏酸等三萜类化合物，以及β-谷甾醇、3，5-二甲氧基苯甲醛。　　3)对所分离得到的三萜类化合物进行了抗肿瘤作用筛选，结果显示，在50μg/mL浓度下，熊果酸、表熊果酸、路路通酸和白桦脂酸对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的抑制率分别为95.3％、93.5％、92.6％及94.9％。IC50分别为33.28、43.57、64.20和74.01μM/mL。　　2.路路通酸纳米粒的制备及特性　　1)制备及表征:以天然两亲分子甜茶苷为新型药物载体，采用溶剂蒸发法，利用分子自组装技术在乙醇溶液中制备路路通酸纳米粒。并对所制备的路路通酸纳米粒进行了粒度分析、透射电镜观测、含量分析、临界胶束浓度测量及溶解性测试等特性分析。结果显示制备的路路通酸纳米粒均匀，平均粒径为4.5±0.6 nm，多分散系数为0.22，药物载体的临界胶束浓度为4.2mg/mL，包埋率可达80％，具有良好的稳定性。　　2)溶解度测定:路路通酸纳米粒在水中的溶解度为740μg/mL，与原化合物相比路路通酸纳米粒溶解度提高了457倍，其水溶性显著增加。　　3)通透性研究:建立了人源结肠腺癌细胞系Caco-2单层细胞模型细胞，采用LC-MS的方法分析了路路通酸和路路通酸纳米粒的转运过程，结果表明，路路通酸纳米粒与原化合物相比，细胞通透性提高了3倍以上。　　4)药动学研究:考察大鼠静脉注射路路通酸纳米粒的药动学过程。以路路通酸混悬液为对照，路路通酸纳米粒组的时间曲线下面积AUC及平均最大血药浓度Cmax高于对照组;消除半衰期T1/2比对照组延长。表明路路通酸纳米粒能够改善大鼠体内路路通酸的药动学行为，延长体内滞留时间。　　3.路路通酸及路路通酸纳米粒抗肿瘤作用研究　　1)体外抗肿瘤作用:路路通酸纳米粒对乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肠癌细胞HT-29、前列腺癌细胞UC-145的增殖均有较强的抑制作用，对三种肿瘤细胞增殖抑制作用的IC50分别为69.21μM、65.09州及57.99μM/mL。具有广谱抗肿瘤作用。　　2)对肿瘤细胞凋亡的影响:采用Hoechest33258荧光染色法测试，路路通酸及其纳米粒药物处理组乳腺肿瘤细胞收缩变小，细胞核固缩深染，荧光加强，出现典型的凋亡特征，路路通酸纳米粒诱导乳腺癌细胞的凋亡作用强于路路通酸。　　3)抗肿瘤作用机制:路路通酸纳米粒呈现上调P53、Caspase3基因的mRNA表达水平的趋势。路路通酸纳米粒明显上调Caspase9基因的mRNA表达水平。路路通酸纳米粒促进凋亡的作用机制是通过调节促凋亡因子Caspase9达到抗肿瘤作用。　　4)体内抗肿瘤作用:路路通酸纳米粒对小鼠移植性S180实体瘤均具有显著抑制作用，高、中、低三个剂量组对实体瘤的抑瘤率分别为49.78％、30.06％、26.71％，纳米粒组抑瘤率约高于同等剂量的路路通酸组50％。路路通酸纳米粒对小鼠免疫器官具有保护作用，高、中、低三个剂量组的胸腺指数分别为:3.19、2.15、2.60 mg/g;脾脏指数分别为:5.30、5.38、5.88 mg/g。肿瘤细胞形态观察显示药物处理组肿瘤细胞核染色质呈现出凋亡特征。　　4.路路通酸的合成及结构修饰:对羽扇豆烷型天然五环三萜进行结构修饰，以白桦脂醇为原料合成了路路通酸，并设计改造C-28位合成了14个新的衍生物。其中28-叔丁胺取代物及28-N，N-二甲基乙二胺取代物对MDA-MB-231肿瘤细胞的IC50值分别是38.37μM/mL和8.44μM/mL，得到了抗肿瘤增殖活性较强、优于原料的化合物。Hoechest33258荧光染色显示二者有促进肿瘤细胞凋亡作用。发现了对路路通三萜衍生物的结构改造在白桦脂醇28位引入脂肪胺时，获得了抑制肿瘤细胞生长的活性更强的新衍生物。　　结论:从中药路路通中分离了的抗肿瘤成分，主要为三萜化合物。通过制备三萜酸纳米复合粒子，增加路路通三萜酸水溶性和细胞通透性，延长了药物体内滞留时间。路路通酸及其纳米粒的抗肿瘤作用不仅能够抑制肿瘤的生长，而且能诱导肿瘤细胞发生凋亡，并能抑制小鼠移植肿瘤的生长和转移。三萜衍生物的结构改造获得了更强的肿瘤细胞抑制效果，显示他们作为抗肿瘤药物的潜在可能性。本项目为路路通的进一步开发提供基础研究工作。