P120-catenin(p120ctn)是catenin家族的重要成员。它可以通过与E-cadherin(E-cad)直接结合形成E-cadherin/catenin复合体调节细胞黏附。但是,由于p120ctn亚型的存在,不同亚型的p120ctn对细胞黏附的作用还存在较大争议。同时,p120ctn在细胞黏附中发挥的作用还可能受到E-cad表达位置的影响。因此,p120ctn不同亚型在肺癌细胞黏附中是怎样发挥作用的,其功能与E-cad表达位置具有怎样的关系,p120ctn调节E-cad表达可能的功能区域在什么位置等,目前尚不十分清楚,为此,本研究筛选了E-cad不同亚细胞定位的肺癌细胞系,通过双向调控p120ctn及亚型的表达,探讨p120ctn不同亚型在细胞黏附中的作用以及P120ctn调节E-cad表达的可能功能区域。　　 实验材料和方法：　　 1、细胞培养在37℃,含5％CO2的培养箱内培养人类肿腺癌细胞系SPC和人类大细胞肺癌细胞系H460,培养于含10％灭活胎牛血清,2.3g/L NaHCO3,100units/ml青链霉素的RPMI1640(Invitrogen,美国)培养液中,贴壁生长,每2-3天用0.25％胰酶(Invitrogen,美国)消化传代。　　 2、Western Blot将含80μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后,转印至PVDF膜,单克隆抗体p120ctn,E-cad或GFP4℃孵育过夜,辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育2小时后ECL显色。　　 3、质粒构建与转染将分别含有目的基因的载体导入感受态宿主细菌DH5α中扩增、纯化,测序验证后,使用Lipofect2000转染试剂将质粒分别转染至肺癌细胞系中,通过Western Blot鉴定转染效果。　　 4、Transwell方法检测细胞侵袭能力按照BD公司说明操作,取100μl细胞悬液(5×106个/ml)滴入上室内,下室加入含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液,上下室之间用孔径为8μm的聚碳酸酯微孔滤膜分开,将小室置37℃,5％CO2条件下放置后,弃去上室内液体,擦尽膜上Matrigel胶,100％甲醇固定30分钟,常规苏木素染色,光镜下计数细胞数。　　 5、间接免疫荧光检测固定后的细胞爬片用0.2％ Triton X-100处理15分钟,非免疫动物血清封闭,一抗为单克隆抗体mouse anti-E-cad4℃孵育过夜;二抗为异硫氰酸荧光素(FITC)标记或罗丹明标记(TRITC)标记的山羊抗小鼠IgG,碘化丙啶或DAPI进行核复染。50％缓冲甘油封片,荧光显微镜Olympus IX51于波长为527nm处观察罗丹明荧光强度,于372nm波长处观察DAPI的荧光染色观察并照相。阴性对照实验:用等量的0.01mol/L PBS代替一抗。　　 结果：　　 1、干扰肺癌细胞系中p120ctn的表达可以下调E-cad蛋白水平,但对肺癌细胞侵袭能力的影响依E-cad的不同定位而不同。　　 在E-cad和p120ctn均定位于细胞连接处的H460肺癌细胞系中,转染p120ctn干扰质粒后,Western Blot及免疫荧光检测发现E-cad表达蛋白减少,并且E-cad在细胞连接处表达消失,胞浆处可以检测到微量的E-cad表达,同时,Transwell侵袭实验证实细胞侵袭能力增强。相反,在E-cad和p120ctn均定位于胞浆的SPC细胞系中,转染p120ctn干扰质粒后,Western Blot及免疫荧光检测发现SPC细胞胞浆中E-cad蛋白表达减少,并且细胞侵袭能力减弱。　　 2、p120ctn亚型1和亚型3对E-cad有着不同的调节作用。　　 H460及SPC肺癌细胞系中转染p120ctn干扰质粒后,再分别转染p120ctn亚型1及亚型3质粒,我们发现H460细胞系中转染p120ctn亚型1的质粒后,E-cad蛋白表达增高,E-cad重新恢复其在细胞连接处的表达,Transwell侵袭实验证实细胞侵袭能力减弱;而转染p120ctn亚型3质粒后,E-cad表达水平虽没有改变,但仍可恢复其侵袭能力。而在SPC细胞系中转染p120ctn亚型1质粒后,E-cad蛋白表达水平上调,同时细胞侵袭能力增强;而转染p120ctn亚型3质粒后,E-cad蛋白水平无变化,但细胞侵袭能力得到一定程度的恢复。　　 3、p120ctn亚型1对E-cad的调节作用依赖于其N-末端的1-54位氨基酸序列H460和SPC细胞中转染干扰p120ctn质粒后,再分别转染p120ctn亚型1的5种剪切体质粒,其中只有含有N-末端1-54位氨基酸序列的M5剪切体质粒可以使E-cad蛋白表达上调,其它剪切体对E-cad的表达无调节作用,并且转染M5剪切体质粒后,能够恢复H460细胞中E-cad在细胞连接处的表达,细胞的侵袭能力减弱;而SPC细胞系中,转染M5剪切体质粒虽然能够使E-cad在胞浆中的表达升高,但不能使E-cad表达于细胞连接处,同时细胞的侵袭能力增强。　　 结论：　　 1.E-cad在细胞中的表达和定位受到p120ctn亚型1的影响;p120ctn亚型1对细胞侵袭能力的影响依E-cad在细胞中表达位置的不同而不同,而p120ctn亚型3对细胞中E-cad的表达没有影响,但也可增强细胞的侵袭能力。　　 2.p120ctn亚型1调节E-cad的表达依赖于N-末端1-54位氨基酸序列及Arm结构的存在。