基于对细菌在龋病这一感染性疾病中关键作用的深入理解，近年来许多学者都致力于研发新型具有抗菌性能的功能性齿科材料。以往通过直接添加可溶性有机抗菌剂或无机抗菌剂对齿科材料进行抗菌改性的方法因抗菌剂的突释效应及对材料本身机械性能的不利影响已逐渐被学者们抛弃。“可聚合抗菌剂”是一种具有聚合功能的抗菌剂，其能够通过共价键将抗菌功能基团稳固交联结合于基质材料，从而赋予基质材料不依赖活性成分释放的、稳定的接触抑菌功能，是研发新型抗菌齿科修复材料的新策略。日本的Imazato教授在国际上最先合成可用于齿科树脂基材料的可聚合抗菌剂甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡啶（methacryloyloxydodecylpyridiniumbromide，MDPB）单体，并在此基础上研发出目前国际上唯一商品化的抗菌粘接系统。近年来，本人所在课题组在国内率先开展了可聚合抗菌剂的研究，合成了与MDPB结构类似的多种抗菌单体。这些抗菌单体均依赖其分子结构中的季铵基团发挥抗菌作用，因此被统称为季铵盐型抗菌单体。本课题组通过前期性能检测优选出甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡啶（methacryloxylethyl cetyl dimethyl ammonium bromide，DMAE-CB）进行齿科树脂基材料抗菌改性研究，并证实将DMAE-CB添加到粘接剂或窝沟封闭剂中可以在不显著影响材料本身理化性能的同时赋予其稳定的抑菌功能。但是，基于抗菌单体的功能性齿科材料在临床上的成功应用不仅依赖于其良好的抗菌性能和理化性能，还在很大程度上取决于其生物安全性能。因此研究季铵盐型抗菌单体的细胞毒性及其引起细胞毒性的机理、并探索可能的保护措施具有重要的意义。但是目前尚无这方面的研究。1.研究目的本研究首先以MDPB和DMAE-CB为代表，比较不同结构的季铵盐单体抗菌性能、细胞毒性的差异，并在此基础上探索其细胞毒性的机制并寻找可能的降低其细胞毒性的措施，为日后改善抗菌齿科树脂基材料的生物安全性、拓展其在深龋及牙髓保护方面的应用提供理论及实验支持。2.主要研究方法：2.1.通过最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）测试、最小杀菌浓度（Minimal bactericidal concentraion，MBC）测试、快速杀菌实验评价并比较两种季铵盐型抗菌单体DMAE-CB与MDPB的抗菌效应，并研究抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）对上述单体抗菌性能的可能影响。2.2.采用死菌/活菌荧光染色和激光共聚焦显微镜观察比较DMAE-CB和MDPB对黏附状态细菌的快速杀灭作用。2.3.采用3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5二苯基四氮唑溴盐法（MTT法）评价DMAE-CB与MDPB对细胞增殖及存活情况的影响，并研究抗氧化剂NAC和纳米铂凝胶颗粒（Colloidal platinum nanoparticles，CPtN）对抗菌单体细胞毒性的可能影响。2.4.通过检测成骨细胞碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）的活性，评价DMAE-CB与MDPB对成骨细胞分化的影响，并探索NAC对上述单体引起的分化抑制的可能影响。2.5.通过ALP-冯库萨染色检测两种季铵盐型抗菌单体DMAE-CB与MDPB对成骨细胞矿化功能的影响。2.6.采用荧光染色和流式细胞仪分析技术，评价季铵盐型抗菌单体对细胞增殖、细胞分裂周期、细胞凋亡和坏死的影响，探索细胞内氧化应激及线粒体依赖性凋亡通路是否与抗菌单体的细胞毒性作用有关。2.7.通过western blot技术，探索铵盐型抗菌对细胞内Bcl-2、Bax及细胞色素C等线粒体依赖性凋亡通路的相关分子的表达及分布的影响，明确线粒体依赖性凋亡通路在抗菌单体引起的细胞死亡中的作用。3.主要研究结果3.1. DMAE-CB的MIC（3.91-7.81μg/mL）和MBC（7.81μg/mL）值低于MDPB（MIC：7.81-31.3μg/mL；MBC：125-250μg/mL），提示DMAE-CB抗菌性能强于MDPB。3.2.季铵盐型抗菌单体对游离及黏附状态下的变形链球菌均具有快速杀灭作用，且DMAE-CB的作用强于MDPB。3.3.季铵盐型抗菌单体对成骨细胞的增殖和存活具有抑制作用，DMAE-CB的抑制作用强于MDPB，但与常用牙科单体Bis-GMA的抑制作用相当。3.4.季铵盐型抗菌单体对成骨细胞的分化具有抑制作用，且较低浓度的上述抗菌单体即可引起细胞分化的显著抑制。3.5.季铵盐型抗菌单体对成骨细胞的矿化功能具有抑制作用，可显著减少钙沉淀的形成。3.6.季铵盐型抗菌单体可引起小鼠成纤维细胞细胞周期的紊乱，并使其通过凋亡和坏死两种方式发生死亡。3.7.季铵盐型抗菌单体可引起小鼠成纤维细胞内活性氧（Reactive oxygenspecies，ROS）水平呈时间及浓度依赖性上升。3.8.季铵盐型抗菌单体可引起小鼠成纤维细胞内线粒体膜电位的丧失、下调抑凋亡分子Bcl-2的表达，上调促凋亡分子Bax的表达，并促进细胞色素C从线粒体向细胞质转位，提示抗菌单体激活了线粒体依赖性凋亡通路。3.9.抗氧化剂NAC对季铵盐型抗菌单体的细胞毒性具有一定的缓解作用，但抗氧化剂CPtN却增强了其毒性。3.10.抗氧化剂NAC对季铵盐型抗菌单体引起的成骨细胞分化的抑制没有显著影响。3.11.抗氧化剂NAC在可降低细胞毒性的浓度（10mM）下对DMAE-CB和MDPB的快速杀菌活性没有显著不利影响。4.主要结论4.1.季铵盐型抗菌单体对游离及黏附状态下的细菌均有快速杀菌作用，且DMAE-CB的抗菌性能强于MDPB。4.2.季铵盐型抗菌单体对成骨细胞的增殖、分化和矿化有不利影响，且DMAE-CB的毒性稍大于MDPB，但DMAE-CB对细胞增殖的影响与常用交联单体Bis-GMA相当。4.3.季铵盐型抗菌单体的细胞毒性与ROS过量产生有一定关系，并可以导致细胞周期的紊乱、凋亡及坏死的发生。4.4.季铵盐型抗菌单体可以激活线粒体介导的凋亡通路，并导致部分细胞通过凋亡模式发生死亡。4.5.抗氧化剂NAC对季铵盐型抗菌单体引起的细胞死亡具有一定的缓解作用，却对其引起的细胞分化抑制作用无显著影响。另一种抗氧化剂CPtN会增强季铵盐型抗菌单体的细胞毒性。4.6.抗氧化剂NAC在可降低细胞毒性的浓度（10mM）下对季铵盐型抗菌单体的快速杀菌作用没有不利影响。综上所述，季铵盐型抗菌单体具有稳定、可靠的快速杀菌作用，同时，其对细胞的增殖、分化、矿化等功能有一定的不利影响。季铵盐型抗菌单体的细胞毒性与细胞内氧化还原平衡的破坏有一定关联。使用抗氧化剂NAC可在不影响抗菌单体抗菌性能的基础上缓解其细胞毒性。基于上述结果我们推测，使用抗氧化剂可以提高含季铵盐抗菌单体的抗菌树脂基材料的生物安全性，进而进一步改善抗菌树脂基材料在深龋及龋源型露髓的保髓治疗方面的效果。