冠心病痰瘀互结证生物学基础研究是证候研究的热点之一,已在分子层面开展相关探索,并取得一定进展,但目前存在研究层面相对孤立,实验设计相对局限,研究结果缺乏说服力等问题,未能建立起不同组学信息间的相互联系等问题,无法系统地阐释其复杂的生物学基础。针对以上问题,本研究通过高通量测序、高分辨质谱等多组学技术与证候研究相结合,筛选与冠心病痰瘀互结证相关的基因、蛋白质和代谢物,运用多算法生物信息学分析,整合多组学生物信息,并通过“以药测证”,观察活血化痰药物对关键因子的影响,以期为阐释冠心病痰瘀互结证生物学基础的研究提供新的思路。目的:探索冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证在基因组、蛋白组、代谢组3个层面的生物学基础;探索冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证基因、蛋白质和代谢物生物标志物;验证冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证生物学机制。方法:1.冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证转录组学研究。使用高通量测序技术检测冠心病痰瘀互结证、冠心病非痰瘀互结、非冠心病痰瘀互结证患者以及健康人各5例外周血有核细胞中的mRNA,通过生物医学统计和检验与分组比较分析方法筛选差异表达基因,借助DAVID和STRING平台运用生物信息学方法对差异表达基因进行基因功能、信号通路和蛋白互作关系的分析。根据差异表达基因的生物学意义、表达差异倍数和显著性综合筛选转录层面的目标基因。通过qPCR验证与ROC曲线分析筛选转录组层面的生物标志物。2.冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证血浆蛋白质组学研究。使用DIA蛋白组学技术检测冠心病痰瘀互结证、冠心病非痰瘀互结、非冠心病痰瘀互结证患者以及健康人各6例血浆中的蛋白质,通过生物医学统计和检验与分组比较分析方法筛选差异表达蛋白,借助DAVID和STRING平台运用生物信息学方法对差异表达蛋白进行基因功能、信号通路和蛋白互作关系的分析。根据差异表达蛋白的生物学意义、表达差异倍数和显著性综合筛选蛋白质层面的目标蛋白。通过ELISA验证与ROC曲线分析筛选蛋白组层面的生物标志物。3.冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证血清代谢组学研究。通过LC-MS非靶向代谢组学技术检测冠心病痰瘀互结证、冠心病非痰瘀互结、非冠心病痰瘀互结证患者以及健康人各30例血清中的代谢物,结合多元统计与单变量分析方法筛选差异代谢物,借助MetaboAnalyst平台对差异代谢物进行信号通路和诊断效能分析,根据生物学意义、诊断效能、变量权重值、差异倍数和显著性综合筛选代谢组层面的生物标志物。4.活血化痰中药对冠心病心绞痛痰瘀互结证目标基因的临床干预研究。按照随机对照试验设计,根据西医疾病与中医证候诊断标准纳入经冠脉造影或冠脉CTA确诊的冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证患者30例,试验组(丹蒌片)15例,对照组(丹蒌片模拟剂)15例,按照说明书服用,疗程为4周。使用qPCR技术分别检测两组疗前疗后目标基因的表达量。观察指标包括疗两组前疗后证候积分差值,中医证候有效性以及疗前疗后目标基因的表达量变化,疗效评定参照客观标准。两组证候积分差值比较使用非参数检验,两组中医证候有效性比较采用卡方检验,两组表达量变化比较使用t检验结合U检验。比较目标基因疗后试验组与对照组的相对表达量,表达量改变的整体分布。结果:1.通过高通量测序筛选到98个冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证差异表达mRNA,其中上调基因56个,下调基因42个。通过生物信息学方法分析差异基因的生物过程和信号通路发现,在mRNA层面,冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证的发生可能与免疫和炎症密切相关,涉及的主要生物学过程包括炎症反应、适应性免疫反应、免疫反应等,主要分子功能包括趋化因子活性等,主要信号通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、抗原处理和呈递、趋化因子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。通过综合筛选6个目标基因,并经qPCR验证,CXCL8表达量冠心病痰瘀互结证较健康对照组下降56%,两组差异具有显著性,P=0.000,CCL2表达量冠心病痰瘀互结证较健康对照组下降25%,两组差异不显著,P=0.168,CSF1表达量冠心病痰瘀互结证较健康对照组增加23%,两组差异不显著,P=0.103。ROC曲线分析显示,CXCL8 AUC为0.844,CCL2 AUC为0.699,CSF1 AUC为0.626。经综合分析,CXCL8可作为冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证生物标志物,CCL2、CSF1可作为候选生物标志物。2.通过DIA蛋白组学鉴定技术筛选出104个冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证差异蛋白,无功能注释蛋白92个,多为免疫球蛋白片段,已有功能注释的蛋白22个,其中21个蛋白表达上调,1个蛋白表达下调。通过生物信息学方法分析差异蛋白的生物过程和信号通路发现,在蛋白质层面,冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证的发生可能与免疫和凝血密切相关,涉及的主要生物学过程包括免疫调理作用、固有免疫反应、凝血等,主要分子功能包括结构分子活性、细胞粘附分子结合等,主要信号通路包括补体和凝血级联信号通路和血小板活化信号通路等。通过综合筛选2个目标蛋白,并经ELISA验证,SERPIND1表达水平在冠心病痰瘀互结证较健康对照组显著上调,差异具有统计学意义(P=0.003<0.05),结果与质谱分析结果一致。FGB表达水平在CHD TYHJ组和Control组差异不显著(P=0.365>0.05)。ROC曲线分析显示,SERPIND1 AUC为0.768。经综合分析,SERPIND1可作为生物标志物。3.通过LC-MS非靶向代谢组学技术和多元统计学方法筛选出20个冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证差异代谢物,通过生物信息学方法分析差异代谢物涉及的信号通路发现,在代谢物水平,冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证的发生可能与氨基酸代谢、甘油磷脂代谢、类固醇激素生物合成等密切相关。ROC曲线分析显示,8个代谢物AUC>0.85,分别为5alpha Pregnan 20alpha 01 3 one、Dopamine、2 Arachidonylglycerol、Allantoic acid、Acetylhomoserine、5 Hydroxy L tryptophan、Ribothymidine、1,2,3 Propanetricarboxylic acid。经综合筛选,5alpha Pregnan 20alpha o1 3 one、Dopamine、Allantoic acid、5 Hydroxy L tryptophan AUC、LysoPC(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、3,4 Dihydroxybenzeneacetic acid AUC、Homogentisic acid具有作为冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结正代谢物层面生物标志物的潜能。4.临床干预研究结果显示,两组证候积分差异比较,实验组减少27(15,29)分vs对照组减少11(3,15)分,P=0.004;两组有效性比较,试验组有效12人80.00%vs对照组5人33.33%,P=0.010。qPCR定量分析显示,治疗组与对照组比较,CXCL8表达量增加22%,CCL2相对表达量增加57%,CSF1相对表达量下降20%,SERPIND1相对表达量增加309%。T检验P值分别为0.201、0.201、0.153、0.908,U检验P值0.165、0.110、0.237、0.820。以上四个基因在CHD TYHJ患者中的表达较健康对照组分别为CXCL8下调,CCL2下调,CSF1上调,SERPIND1上调。干预后冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证患者证候改变的同时,CXCL8表达增加,CCL2表达增加,CSF1表达下降,SERPIND1表达下降。疗后目标基因各样本的分布同样呈现与表达量一致的变化,提示了以上四个基因可以作为冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证生物标志物。结论:①冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证存在转录组学差异表达谱,其通路与生物功能与免疫和炎症反应相关;②冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证存在蛋白质学差异表达谱,其通路与生物功能与免疫反应和凝血密切相关;③冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证存在代谢组学差异表达谱,其通路与生物功能与氨基酸代谢、甘油磷脂代谢和类固醇激素生物合成相关;④多组学联合研究发现免疫反应是冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证发生发展的生物学基础之一;⑤CXCL8、CCL2、CSF1、SERPIND1可作为其生物标志物。