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细菌耐药问题已经引起世界各地的广泛关注,规范合理使用抗生素已迫在眉睫。国内畜禽养殖中应激普遍存在,胃肠道内的去甲肾上腺素等儿茶酚胺类激素是宿主响应急性应激的主要激素。细菌在动物肠道这个复杂的环境中,面对重金属和抗生素的双重压力,很容易对二者产生抗性。那么肠道大肠杆菌重金属抗性与抗生素耐药性是否相关?饲料高铜的添加是否加剧了耐药基因的水平传播?宿主的应激激素是否参与致病菌在宿主肠道环境中的适应以及进化?本论文拟围绕上述三个关键问题开展深入系统研究,试验分为三个部分:试验一去甲肾上腺素对大肠杆菌耐药质粒接合转移的影响本试验拟通过比较去甲肾上腺素诱导和未诱导的大肠杆菌分离株耐药质粒体外接合转移率的差异,和供、受体菌株及接合子的抗生素耐受水平的变化,探讨生产中普遍存在的急性应激因素对细菌耐药基因水平转移的可能影响。选取分离自断奶香猪粪便的2株喹诺酮类敏感型大肠杆菌作为试验菌株,通过测定OD600值比较菌株在添加不同去甲肾上腺素浓度培养液中的生长曲线,确定去甲肾上腺素对于大肠杆菌的最佳促生长浓度;分离自断奶香猪粪便的7株携带质粒喹诺酮类耐药基因(aac(6’)-lb-cr,oqxAB,qnrS)的大肠杆菌,采用滤膜接合法,计算去甲肾上腺素诱导和未诱导的大肠杆菌分离株(供体菌)与大肠杆菌J53(受体菌)的接合转移率;PCR检测接合子及供、受体菌质粒介导抗性基因的携带情况;采用K-B纸片扩散法和琼脂稀释法测定接合子及供、受体菌的多种抗生素MIC值。结果发现,去甲肾上腺素对于大肠杆菌的促生长效果具有浓度依赖性,最佳促生长浓度为100 μmol/L。7株携带质粒介导的喹诺酮类耐药基因的大肠杆菌中有4株(A、B、C、D)成功获得接合子,经去甲肾上腺素(100 μmol/L)诱导后与受体菌的接合转移率与去甲肾上腺素未诱导组相比均升高,其中A、B、C 3株供体菌极显著升高(P<0.01)。所有接合子均扩增到恩诺沙星3种耐药基因:aac(6’)-lb-cr,oqxAB,qnrS。接合子菌株对6种抗菌药物的MIC值大部分与供体菌株相同或降低。去甲肾上腺素提高了大肠杆菌分离株耐药质粒体外接合转移率,且对于大肠杆菌的促生长效果具有浓度依赖性。提示动物养殖生产中应加强对于应激的管理,以减少细菌耐药基因水平传播的发生。试验二日粮高铜和口服头孢噻呋对大鼠肠道内大肠杆菌blaCTX-M-1接合转移的影响本试验通过给饲喂不同铜水平日粮的大鼠灌喂一株blaCTX-M-1阳性耐利福平大肠埃希菌EC600,比较头孢噻呋处理前后不同铜水平组大鼠粪源敏感型肠杆菌和耐受CTX肠杆菌计数结果的变化,并通过体外接合试验比较该菌株在不同铜水平下接合转移率的差异,探讨高铜和抗生素对blaCTX-M-1在大肠杆菌间水平传播的影响。在体试验以32只SPF级雄性SD大鼠为对象,根据日粮中铜的添加水平及抗生素灌喂与否将其随机分为4组,分别为低铜对照组(C-组,铜:6mg/kg,不灌喂头孢噻呋),低铜试验组(C+组,铜:6mg/kg,灌喂头孢噻呋),高铜对照组(H-组,铜:240mg/kg,不灌喂头孢噻呋),高铜试验组(H+组,铜:240mg/kg,灌喂头孢噻呋)。于第20d、22d、24d所有大鼠给予携带blaCTX-M-1的耐利福平大肠埃希菌EC600菌液灌喂,试验组(C+和H+)大鼠于第26d、27d、28d灌喂治疗剂量的盐酸头孢噻呋,对照组(C-和H-)大鼠灌喂等体积食用油。分别采集头孢噻呋灌喂前后大鼠新鲜粪便样品,进行Mac平板和CTX-Mac平板计数,对CTX-Mac平板分离的肠杆菌进行blaCTX-M-1耐药基因常规PCR检测。在体大鼠菌落计数结果发现,灌喂抗生素后,试验组耐受CTX肠杆菌计数极显著高于其相对应的对照组(C+vsC-;H+vsH-)(P<0.01)。试验组与其相应对照组相比,blaCTX-M-1基因的检出率维持在较高的水平。H-组与C-组相比blaCTX-M-1基因的总检出率较高,且停止用药后C-组blaCTX-M-1基因消失的速度与H组相比较快,而C+组与H+组未看到有此差异。体外接合试验以灌喂菌株作为供体菌,分离自试验大鼠的4株敏感型肠杆菌作为受体菌,结果显示高铜(12 mmol/L)诱导后的接合转移率极显著高于低铜(2 mmol/L)的对照组(P<0.01).综上所述,高铜促进了耐药基因的水平传播和维持,但在高铜与抗生素共同存在时,抗生素对于耐药菌的维持效果更加明显。试验三blaCTX-M-1阳性基因在饲喂不同铜水平日粮的大鼠肠道内的接合转移本试验通过XbaI-PFGE分型分析饲喂不同铜水平日粮的大鼠粪源肠杆菌之间的同源性关系,对大鼠粪源blaCTX-M阳性肠杆菌进行受体菌的追踪溯源,采用S1-PFGE及Southern杂交对携带blaCTX-M-1基因的质粒转移进行印证,分析大肠杆菌接合性质粒的传播机制。本研究对上一章动物试验的C-组(低铜对照组)和H-组(高铜对照组)大鼠肠道分离敏感型肠杆菌和blaCTX-M阳性肠杆菌进行同源性分析,结果发现C-组34株大鼠粪源敏感型肠杆菌可分为9个不同的PFGE型(低于85%的相似度),H-组分离的31株大鼠粪源敏感型肠杆菌同样可分为9个PFGE型,并且分别在两组成功的找到了与动物试验中的接合子(大鼠粪源blaCTX-M阳性肠杆菌)相对应的受体菌(大鼠粪源敏感型肠杆菌)。对动物试验中的接合子和其相应受体菌,以及灌胃菌株TC4-2、制备灌胃菌株的供体菌4号菌株同时进行S1-PFGE及Southern杂交,S1-PFGE结果表明blaCTX-M-1基因存在于约67kb的质粒上;用地高辛标记的blaCTX-M-1基因胶回收产物作探针进行Southern杂交,在4号菌株,TC4-2,以及大鼠粪源blaCTX-M阳性肠杆菌出现杂交带,而其相对应的受体菌未出现杂交带。综上所述,大鼠肠道内肠杆菌可以通过接合的方式将携带blaCTX-M-1基因的质粒转移到受体菌,从而实现耐药基因在不同细菌之间的传播和扩散。