研究背景:周围神经缺损的修复以自体神经移植效果最佳。但可供移植的自体神经来源有限,且切取后有供区麻木、疤痕、神经瘤等并发症,故难以满足粗大、长段神经缺损修复的需要。化学去细胞同种异体神经是新型生物组织工程材料——免疫源性低、内部天然结构保留完整,可以引导宿主许旺细胞迁移并促进轴突再生,已逐渐成为自体神经移植较理想的替代物。目前比较棘手的难题是神经缺损修复后,神经再生的质量和速度不尽人意。周围神经损伤修复后,能否成功再生主要取决于是否具有适合其生长的微环境条件。包括肝细胞生长因子(HGF)在内的神经营养因子(neurotrophicfactors,NTFs)是再生微环境中的重要因素,对再生神经的生长和走向起重要的营养和诱导作用。外周神经系统损伤后,内源性HGF表达的增加可以保护神经元,加快轴突的生长,促进神经纤维的修复。但是由于其存在时间及浓度有限,加之外源性的HGF重组蛋白纯化困难,半衰期短——都不能完全满足神经再生的需要。基因技术是提供神经营养因子的良好工具,它可以将目的基因提供给受损部位并持续表达,促进神经生长。本研究将腺病毒载体介导的人肝细胞生长因子基因局部注射,通过骨骼肌细胞的转染,持续表达目的蛋白(HGF)——观察其在周围神经损伤修复中的可行性及对神经生长的作用,为进一步的临床试验提供依据。方法:(1)检测携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)体外对小鼠骨骼肌细胞的转染效率以及转染细胞对目的蛋白的表达。以不同感染复数(M.O.I)(0、50、100、200、400)的Ad-GFP(携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒)感染骨骼肌细胞,48小时后用流式细胞仪检测转染效率。Ad-HGF(MOI=400pfu/cell)转染小鼠骨骼肌细胞,每48h收集培养上清,对照组转染Ad-GFP,ELISA法检测上清中HGF的表达,持续至第14天。(2)化学去细胞同种异体神经修复Wistar大鼠坐骨神经10mm缺损后,近、远端吻合口附近肌肉分别注射腺病毒介导的人肝细胞生长因子(异体神经+HGF组),与自体神经移植组和无HGF作用异体神经组(异体神经组)对照,通过步态分析、肌肉湿重测定、轴突生长速率测定、神经电生理、计算机图像分析等指标评价神经移植后再生效果。(3)以Wistar大鼠坐骨神经挤挫伤(Crush)为动物模型,神经损伤局部肌肉注射腺病毒介导的人肝细胞生长因子(Crush+HGF组),与无注射HGF组(Crush组)对照,通过步态分析、肌肉湿重测定、计算机图像分析等指标评价神经损伤后再生效果。(4)借鉴Hudson发明的异体神经化学萃取方法(简称Hudson法),综合应用萃取剂Triton X-200、SB-10和SB-16对犬坐骨神经的化学处理方法进行改良,并与Sondell发明的异体神经化学萃取方法(简称Sondell法)(应用萃取剂Triton X-100和脱氧胆酸钠)进行比较,从细胞、髓鞘的去除,结构完整性保存等方面综合评价移植物的质量,建立一种新型的神经萃取方法。(5)按照第四部分建立的神经萃取方法制备犬去细胞异体神经,修复犬坐骨神经5厘米缺损;近、远端吻合口附近肌肉分别注射腺病毒介导的人肝细胞生长因子(异体神经+HGF组),与自体神经移植组和无HGF作用异体神经组(异体神经组)对照,通过神经电生理、组织学观察、计算机图像分析等指标评价神经移植后再生效果。结果:(1)在Ad-GFP转染骨骼肌细胞48h时,GFP的表达明显增强,荧光显微镜观察可见绿色荧光。流式细胞仪检测转染效率:随着MOI的增大,转染效率明显提高。骨骼肌细胞转染HGF后,ELISA法定期检测其表达。48h时,HGF的表达与对照组相比明显增加,可达131ng/mL。随着时间的推移,表达量开始降低,第8d明显降低,随后维持一个相对稳定的水平。(2)术后16周同自体神经移植对比,去细胞异体神经可以修复大鼠周围神经缺损。在步态分析、肌肉湿重测定、轴突生长速率测定、计算机图像分析等指标评价中,异体神经+HGF组与异体神经组的差异具有明显统计学意义,异体神经+HGF组与自体神经移植组的差异没有统计学意义。神经移植体内新生血管面积与移植物横截面积比例的比较,异体神经+HGF组与异体神经组和自体神经移植组的差异分别具有明显统计学意义。(3)术后4周,在步态分析、肌肉湿重测定、轴突生长速率测定、计算机图像分析等指标评价中,Crush+HGF组与Crush组的差异具有明显统计学意义。(4)通过组织学观察和综合质量评分比较,改良Hudson法组制备的犬去细胞异体神经,可以在去除许旺细胞、髓鞘等免疫源性物质的同时较好地保留基底膜管结构。(5)尽管采取石膏、假肢固定等保护措施,仍不能避免动物自虐,舔食患趾。因不能观察患肢功能恢复,提前宰杀术犬5只,仅剩余一只。术后6月神经电生理和组织学观察表明,再生神经纤维已经通过近远端吻合口。结论:(1)携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)的构建是成功的,体外实验显示了其生物学活性,为基因治疗的临床应用提供了实验依据。(2)复合肝细胞生长因子的化学去细胞异体神经能促进神经轴突生长速度,显著增加移植物内新生血管,满意修复一定长度周围神经缺损,可以成为一种有效的周围神经组织工程修复材料。(3)肝细胞生长因子能促进大鼠坐骨神经损伤后的有髓纤维再生和功能恢复,是一种有效的治疗周围神经损伤的神经营养因子。(4)综合运用萃取剂Triton X-200、SB-10和SB-16的化学萃取方法,是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法,能够制备出免疫物质清除彻底、神经结构保存较好的犬去细胞异体神经移植物。