耻垢分枝杆菌整合宿主因子的结构和功能研究

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细菌的染色体必须压缩在接近三个数量级的细胞空间内,在压缩的同时,还要和各种DNA活动兼容,包括复制、转录、修复、重组和整合等。拟核相关蛋白在染色体组织中发挥着至关重要的作用。结核分枝杆菌(Mycobaterium tuberculosis)是结核病的病原菌,每年导致数百万人的死亡。对于分支杆菌基本生物学特性的研究有助于新的药物及治疗手段的研发。  目前对于分枝杆菌染色体的组织和拟核相关蛋白的研究远远不如E.coli,B.subtilis和C.crescentus等。不同细菌所编码的染色质蛋白的种类及功能具有明显的多样性。分枝杆菌编码三种主要的拟核相关蛋白一类组蛋白HU、Lsr2和整合宿主因子(mIHF)。mIHF仅在放线菌中保守,而与其它细菌所编码的IHF序列相似性很低。已有研究表明mIHF对分枝杆菌的生长是必需的,因此本论文对来源于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的IHF(MsIHF)的生化性质和结构进行了详细研究。  从一种M.smegmatis mc2155中分离了天然MsIHF蛋白,通过质谱分析确定其不存在翻译后修饰如乙酰化、甲基化和磷酸化。既而在E.coli中表达并纯化了重组MsIHF蛋白,该蛋白以同二聚体的形式存在。通过检测MsIHF与DNA的相互作用发现,MsIHF结合随机序列DNA和含有attB核心序列DNA的亲和力没有区别,MsIHF与DNA的亲和力对盐浓度非常敏感。  在本论文中,系统研究了MsIHF对DNA拓扑结构的影响。结果表明,与线性和开环相比,MsIHF对负超螺旋DNA具有一定的结合偏好性;而且,该蛋白可以有效的固定DNA负超螺旋。进一步的研究表明,MsIHF可以调控拓扑异构酶的活性。MsIHF的结合明显抑制拓扑异构酶Ⅰ的松弛活性;而与此相反,该蛋白可以轻微的促进旋转酶引入DNA负超螺旋的能力。以上结果提示,MsIHF可能通过改变DNA的拓扑学性质或异构酶活性来调节染色体DNA的结构,进而调控其包装。  为了研究MsIHF包装DNA的机制,采用全内反射荧光显微术(TIRFM)在单分子水平上观察了MsIHF对DNA的压缩。研究发现,MsIHF可以有效压缩DNA,并将λDNA包装成为高度凝集的结构。进一步的动力学研究显示,该压缩过程包括三个阶段:压缩阶段1-延滞阶段-压缩阶段2。两个压缩阶段的压缩速率有较大差距,说明两者的机制不同。  还解析了MsIHF与16bp DNA复合物的晶体结构,发现一个非对称单元中含有一个dsDNA分子和两个MsIHF单体分子。两个MsIHF分子的结构基本一致,均由5个α螺旋组成。虽然同一条DNA双螺旋上结合的蛋白分子间没有直接的相互作用,但是每个MsIHF分子均分别与相邻非对称单元中的蛋白与DNA存在相互作用。MsIHF主要通过α4和α5两个螺旋的连接区以及α5螺旋的N端部分与DNA接触。与E.coli IHF异二聚体促使DNA形成U型弯曲不同,MsIHF的结合仅使得DNA双链的构象发生了轻微变化。MsIHF-DNA复合物晶体结构与Streptomyces coelicolor中的sIHF与DNA复合物的结构非常相似,提示这一蛋白-DNA互作模式在放线菌中保守。
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