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研究背景:多靶点酪氨酸激酶抑制剂（TKI）索拉非尼是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的可用于晚期肝细胞性肝癌（HCC）病人的一线药品,索拉非尼耐药一直是提高HCC患者生存率的主要阻碍。因此,明晰索拉非尼耐药机制并制定有效的策略来延缓或克服耐药性是一个巨大的挑战和迫切需要。获得性索拉非尼耐药常常与某些分子异常表达相关,其中大部分还与HCC的发生发展有密切联系。人类肿瘤细胞增加的c-Met和/或HGF表达通常与HCC的发展和对索拉非尼的耐药性有关。c-Met,肝细胞生长因子（HGF）受体,也被熟知为酪氨酸激酶受体。c-Met的激活导致受体磷酸化,接头蛋白的募集和各种信号转导途径的随后激活,包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和细胞外调节激酶（ERK1/2）,最终在某些肿瘤细胞类型中影响增殖、存活、迁移和侵袭性等生物学效应。因此,阐明c-Met的受调表达机制及过表达与活化后调控肝细胞癌索拉非尼耐药的重要机制,为基于肝癌开发索拉非尼联合c-Met活性抑制剂的新型治疗策略提供实验和理论依据。目的:评估索拉非尼耐药HCC肿瘤组织和细胞中c-Met的表达水平,阐明c-Met的分子转录调控机制以及c-Met受激活化后驱动HCC进展和索拉非尼耐药的分子机制与生物学效应。方法:1.收集30例耐索拉非尼HCC患者和30例未接受过索拉非尼治疗的HCC患者肿瘤组织病理切片,HE染色观察组织病理学形态变化;免疫组织化学分析c-Met表达水平差异;构建肝细胞癌Huh-7索拉非尼耐药细胞株（Huh-7R）,运用CCK-8、Ed U、细胞划痕实验、克隆形成实验、吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）实验评价耐药细胞株与亲代细胞株之间的细胞活力、增殖、迁移及抗凋亡等生物学效应的差异;蛋白免疫印迹、间接免疫荧光及免疫细胞化学等方法评价Huh-7R细胞株中c-Met表达水平差异。2.生物信息学预测参与调控c-Met基因的转录因子以及结合位点,Ch IP实验验证结合位点;信号通路抑制剂处理耐药细胞（Huh-7R）,蛋白免疫印迹和半定量RT-PCR分析c-Met及转录因子受调信号通路分子水平。3.c-Met过表达腺病毒和c-Met si RNA慢病毒分别转染Huh-7亲代、Huh-7R耐药细胞,分别应用CCK-8、Ed U、克隆形成实验、JC-1、流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染、AO/EB双染法、细胞划痕实验和Transwell等实验分析生物学效应影响;蛋白免疫印迹验证c-Met表达水平及分析信号通路关键分子水平,探讨c-Met表达活化水平对索拉非尼耐药的影响机制。4.建立人肝细胞肝癌裸鼠移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为Control组、索拉非尼组、PHA-665752组、慢病毒联合索拉非尼处理组、c-Met si RNA慢病毒联合索拉非尼处理组和PHA-665752+索拉非尼组共6组,通过定期监测肿瘤体积计算肿瘤生长情况,评估阻抑c-Met表达和或c-Met活化后对体内肝癌异种移植模型肿瘤生长的抑制效应;免疫组织化学染色检测相关激酶变化水平、Ki67评价各处理组增殖水平的差异、HE染色分析组织病理学变化及蛋白质免疫印迹验证各处理组相关信号通路的表达活化水平。结果:1.耐索拉非尼HCC患者与索拉非尼治疗前患者相比统计学上显著过表达c-Met,耐索拉非尼细胞（Huh-7R）和亲代细胞（Huh-7）相比,显著过表达c-Met且具有显著提高的促增殖、迁移及抗凋亡能力。2.MAPK信号通路通过激活转录因子ETS-1促进其与c-Met启动子区结合并上调c-Met转录表达。3.Huh-7亲代细胞过表达c-Met后对索拉非尼失去化疗敏感性,c-Met激活后,下游PI3K/Akt、MAPK信号通路随即处于活化状态;c-Met si RNA和c-Met抑制剂PHA-665752分别降低c-Met表达和活化水平后,阻抑下游信号通路活化,使耐药细胞恢复对索拉非尼的敏感性。4.体内实验中,应用c-Met si RNA和c-Met抑制剂PHA-665752阻抑c-Met表达与活化,下游信号通路活化水平随之被抑制,显著提高索拉非尼的抗瘤疗效。结论:HCC耐药细胞中MAPK信号通路异常活化促进转录因子ETS-1与c-Met基因启动子结合,上调c-Met转录和表达。c-Met过表达与活化通过激活PI3K/Akt、MAPK信号通路增强HCC细胞促增殖、迁移及抗凋亡能力构成肝细胞癌索拉非尼耐药的重要机制。索拉非尼与沉默c-Met表达或与c-Met抑制剂的组合改善了HCC对索拉非尼的抗性,可恢复索拉非尼治疗HCC的疗效。图[32]表[8]参[74]