本论文分为两部分,第一部分主要探究H₂S对血氧饱和度及血红蛋白携氧能力的调控。第二部分主要探究胎盘中H₂S生成酶CBS对宫内生长受限的影响及相关机制。第一部分H₂S是近年来热门研究的三大气体递质之一,涉及到多种生理、病理生理进程。其中,在缺氧过程中,H₂S发挥了重要功能,包括介导颈动脉体对氧气浓度变化的感知,保护缺氧诱导的细胞凋亡、组织损伤等。硫巯基化是H₂S一种蛋白转录后修饰方式,影响蛋白的功能和稳定性,介导了H₂S众多生理功能,之前有文献报道,缺氧条件下红细胞及血液循环中H₂S水平降低。在本研究中,我们也发现,小鼠缺氧后H2S水平降低,同时给与H₂S供体GYY4137能够缓解缺氧诱导的组织缺氧。并且在Cse^-/-小鼠中,H₂S水平降低,同时动脉血氧饱和度降低,组织缺氧,GYY4137治疗后都有所缓解。进一步研究表明,H₂S能够提高肺部换气功能,增加血氧饱和度,缓解组织缺氧。在之前的研究中我们证实Cse基因敲除小鼠红细胞中2,3-BPG含量显著增加,P50增加,血红蛋白与氧气结合能力减弱。同时H₂S供体GYY4137能够恢复红细胞中2,3-BPG水平,降低P50。并且,GYY4137能够直接降低离体培养的红细胞中2,3-BPG的水平,降低P50。在本研究中,我们也发现,H₂S能够降低缺氧诱导的2,3-BPG生成,并且H₂S能够直接降低缺氧条件下离体培养的红细胞2,3-BPG的生成。接下来我们探究了H₂S调控2,3-BPG生成的分子机制。我们证实,H₂S通过硫巯基化血红蛋白,抑制了BPGM释放到包浆,调控了红细胞中2,3-BPG的生成。主要实验结果如下:一、H₂S缓解了缺氧诱导的组织缺氧1.缺氧条件下,H₂S生成减少2.H₂S缓解了缺氧诱导的组织缺氧（1）缺氧条件下SaO₂降低,同时GYY4137能够增加缺氧下的SaO₂。（2）与常氧小鼠组织相比,缺氧组织中缺氧探针染色信号明显增强,同时GYY4137处理缓解了组织缺氧。3.缺氧条件下,外周组织及红细胞中CSE表达降低而CBS没有显著变化二、H₂S缓解了Cse^-/-小鼠组织缺氧为了探究H2S在组织缺氧中的作用,我们构建了Cse基因敲除小鼠。与WT小鼠相比,Cse^-/-小鼠血液循环中H₂S水平降低,同时动脉血氧饱和度降低,组织缺氧。同时GYY4137治疗缓解了Cse^-/-小鼠组织缺氧。三、H₂S减少损伤了肺部结构功能,降低了动脉血氧饱和度接下来我们进一步探究H₂S调控血氧饱和度的机制。1.Cse^-/-小鼠肺部血流灌注没有变化,而GYY4137显著增加了肺部血流2.GYY4137不能通过增加肺部血流灌注提高Cse^-/-小鼠SaO₂,改善组织缺氧吡那地尔能显著降低Cse^-/-小鼠血压,增加肺部血流灌注,但是吡那地尔处理后并不能提高Cse^-/-小鼠SaO₂,也不能改善组织缺氧。3.Cse基因敲除引起的血氧饱和度降低与肺通气无关与WT小鼠相比,Cse^-/-小鼠的气道阻力及肺部的动态顺应性都没有显著变化。4.H₂S缓解了Cse^-/-小鼠的肺损伤,降低了Cse^-/-小鼠肺组织炎症因子水平H&E染色结果显示,与WT小鼠相比,Cse^-/-小鼠肺泡数目显著减少,同时伴随中度的肺间质水肿,炎症因子水平显著增加。GYY4137能够缓解Cse基因敲除造成的肺部损伤,降低炎症因子水平。5.H₂S缓解了缺氧诱导的肺损伤,降低了缺氧诱导的肺组织炎症因子水平与常氧对照相比,小鼠缺氧一天后,肺泡间质中度水肿,同时肺泡数量明显减少,出现炎症细胞浸润,同时肺组织中炎症因子表达升高。GYY4137处理缓解了缺氧造成的肺组织损伤,降低炎症因子水平。四、外周来源的H₂S调控了红细胞中2,3-BPG生成,影响红细胞携氧1.H₂S调控2,3-BPG生成,影响红细胞携氧能力先前的研究表明,在Cse基因敲除的转基因小鼠中,红细胞中的2,3-BPG显著增高,P50增加,GYY4137降低了Cse^-/-红细胞的2,3-BPG及P50。同时GYY4137也能够直接调控离体培养的小鼠和人的红细胞的2,3-BPG及P50。接下来在缺氧动物模型中我们发现:（1）与常氧小鼠相比,GYY4137能够降低缺氧诱导的2,3-BPG及P50的增加。（2）离体培养的小鼠红细胞,GYY4137能够降低缺氧诱导的红细胞中2,3-BPG的生成。2.外周来源的H₂S调控了红细胞中2,3-BPG五、H₂S调控了BPGM的胞浆-胞膜转位1.H₂S调控了BPGM的活性（1）与WT小鼠相比,Cse^-/-小鼠红细胞胞浆中BPGM活性显著增加。GYY4137处理降低了Cse^-/-小鼠胞浆中BPGM的活性;同时在WT小鼠中,GYY4137也能够降低BPGM的活性。（2）H₂S处理离体培养的红细胞能够显著降低胞浆中BPGM的活性。2.H₂S抑制胞膜锚定的BPGM释放到胞浆（1）Western blotting结果显示,与WT小鼠相比,Cse^-/-小鼠红细胞中BPGM胞浆分布增多,同时胞膜分布减少。GYY4137处理减少了Cse^-/-小鼠红细胞中BPGM胞浆分布反之增加胞膜的定位。（2）共聚焦结果显示,在WT小鼠红细胞中,BPGM主要定位在红细胞的细胞膜,而在Cse^-/-小鼠红细胞中,大多数BPGM定位在细胞浆中,同时GYY4137增加了BPGM的细胞膜锚定。（3）Western blotting结果显示,GYY4137增加了离体培养红细胞中BPGM的细胞膜定位反之减少了胞浆表达。（4）共聚焦结果也表明,GYY4137促进离体培养红细胞中BPGM从胞浆到胞膜的转位。六、BPGM与红细胞胞膜蛋白band4.2结合利用CO-IP联合质谱鉴定,确定BPGM与band 4.2相互作用。七、H₂S调控了Hb与BPGM的相互位置1.H₂S抑制了血红蛋白的细胞膜定位（1）在Cse^-/-的小鼠中,胞膜血红素的浓度显著增加,同时,GYY4137能够显著减低Cse^-/-小鼠及WT小鼠红细胞胞膜上血红素的浓度。（2）在离体培养的人和小鼠的红细胞中,GYY4137能够显著减少胞膜血红素浓度。2.band 4.2介导了Hb与BPGM的相关性CO-IP分析表明,与WT相比,在Cse^-/-小鼠的红细胞中,band 4.2与血红蛋白的结合增加,反之band 4.2与BPGM的结合降低。同时,在GYY4137处理的Cse^-/-小鼠中,band 4.2与血红蛋白的结合减少,并且与BPGM的结合增加。3.红细胞血影实验表明H₂S调控了Hb与BPGM的相关性首先,我们制备了人和小鼠的红细胞血影,将其翻转套在硅微粒上,使内膜暴露。向其中加入Hb,同时处理组中再加入GYY4137,检测H₂S是否能影响血红蛋白及BPGM的细胞膜定位。与对照组相比,我们发现H₂S能够减少血红蛋白的细胞膜锚定以及上清中的BPGM。八、H₂S通过硫巯基化Hb降低了Hb的细胞膜定位同时增加了BPGM的细胞膜锚定1.硫巯基化抑制剂抑制了H₂S的作用利用红细胞血影实验,我们证实硫巯基化抑制剂碘乙酰胺能够逆转GYY4137诱导的Hb和BPGM胞膜定位的改变。2.质谱鉴定Hb发生硫巯基化用马来酰亚胺修饰硫巯基化位点,利用SDS-PAGE电泳,荧光下观察凝胶,分离荧光条带,质谱鉴定其中所含蛋白条带,其中评分最高的肽段与血红蛋白匹配,说明血红蛋白可能发生了硫巯基化。3.H₂S调控Hb硫巯基化利用生物素方法富集硫巯基化的蛋白,western blotting检测不同处理下Hb和BPGM条带的变化。（1）在WT小鼠的红细胞中,能够显著观察到血红蛋白的条带,同时在Cse^-/-小鼠中血红蛋白条带较浅,GYY4137处理后,血红蛋白条带相对变浓。（2）没有检测到BPGM条带,说明BPGM没有发生硫巯基化。4.鉴定小鼠和人血红蛋白硫巯基化位点。九、缺氧条件下H₂S减少降低了Hb的硫巯基化,调控了Hb及BPGM的膜转位1.H₂S逆转了缺氧诱导的Hb及BPGM的细胞内转位小鼠缺氧一天后,（1）红细胞膜中Hb浓度显著增加,同时GYY4137处理降低了缺氧小鼠红细胞膜中Hb的浓度。（2）胞浆BPGM的活性显著增加,同时被GYY4137逆转。（3）缺氧后红细胞膜上BPGM的水平显著减少,胞浆中BPGM的分布增加,GYY4137减少了胞浆中BPGM的分布同时增加了胞膜上BPGM的水平。2.红细胞血影实验表明缺氧条件下H₂S调控了Hb与BPGM的相关性。在10%氧气条件下,（1）红细胞血影上血红蛋白浓度增加,同时上清中BPGM的活性增加。（2）GYY4137处理后,红细胞血影上血红蛋白浓度降低,同时上清中BPGM活性降低。3.缺氧降低了Hb硫巯基化利用生物素方法富集了缺氧红细胞中发生硫巯基化的蛋白,western blotting检测表明与常氧小鼠相比,小鼠缺氧后Hb硫巯基化水平下降,同时给与GYY4137处理增加了血红蛋白的硫巯基化。结论常氧条件下,体内H₂S水平正常,从而保护了肺部换气功能,维持红细胞中2,3-BPG在正常水平。缺氧条件下,体内H₂S水平减少,影响肺换气,降低血氧饱和度;同时H₂S水平减少促进红细胞中2,3-BPG的生成,促进红细胞氧气在外周组织的释放,缓解组织缺氧。第二部分宫内生长受限（Intrauterine Growth Restriction,IUGR）是常见的妊娠期并发症,在全世界发病率约为3%-8%。宫内生长受限是指胎儿在妊娠期未能达到其遗传学的生长能力,造成胎儿体重减小,发育异常。宫内生长受限是由一系列潜在因素导致的复杂的多因素紊乱。目前的研究表明,宫内生长受限最重要的原因为胎盘功能异常。胎盘是妊娠期胎儿唯一的胎外器官,为胎儿的生长提供了必须的营养物质及氧气,同时能够分泌激素维持妊娠过程,产生免疫耐受的宫内环境。胎盘功能异常包括胎盘血管发育异常,血流灌注减少,迷路中交换面积减少以及胎盘中营养物质运输功能损伤,最终导致胎儿宫内生长发育过程中不能获得足够的营养物质及氧气,导致宫内生长受限。H₂S是继NO、CO后发现的人体内第三个气体递质。目前的研究表明H₂S参与了多种生理学及病理生理学过程,例如血管舒张、炎症、血管发生、细胞凋亡及氧化应激等。近年来发现H₂S对妊娠期间胎儿生长发育起到了重要的生理功能。在之前的研究中,我们发现在人类子痫前期的胎盘样本中,CBS和CSE的表达均下降,而3-MST表达没有变化。为了探究H₂S及其生成酶在妊娠期间胎盘结构功能的作用,首先我们利用遗传学技术获得了胎盘CBS特异性敲低的转基因老鼠,我们发现,在妊娠期间,并没有出现子痫前期的临床表型,而是出现了胎儿宫内生长受限的临床表型,并且给与H₂S供体后能够缓解,这说明CBS敲低导致的H₂S水平降低会影响胎盘的结构功能,从而导致胎儿宫内生长发育异常。主要实验结果如下:一、胎盘特异性CBS敲低导致IUGR。1.胎盘特异性CBS敲低小鼠的妊娠结局我们利用转基因技术特异性敲低了胎盘中CBS表达,观察小鼠的妊娠结局,结果显示:（1）胎盘CBS特异性敲低后不会影响孕期。（2）与对照组(Cbs^f/f♂×Cbs^f/f♀)相比,胎盘CBS敲低交配组(Cbs^f/f♂×Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre♀和Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre♂×Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre♀)中,Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre基因型胎盘重量及对应的胎儿体重都出现了不同程度的减少。（3）胎盘CBS敲低交配组中,胎鼠离乳前死亡率显著高于对照组。2.胎盘特异性CBS敲低没有导致子痫前期的临床表型。接下来我们观察胎盘CBS敲低是否导致子痫前期的临床表型。结果显示,与对照组(Cbs^f/f♂×Cbs^f/f♀)相比,Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre♂×Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre♀交配组孕鼠（1）GD17.5-18.5尿液中蛋白与肌酐的比值没有显著变化。（2）肾脏没有出现病理学损伤。（3）GD18.5天平均动脉压没有明显升高。（4）母体抗血管生成因子,血管生成因子的浓度都没有显著变化。3.胎盘特异性CBS敲低导致IUGR。与对照组(Cbs^f/f♂×Cbs^f/f♀)相比,GD18.5 Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre♂×Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre♀交配组中Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre胎盘及胎鼠重量都显著小于对照组,并且胎鼠与胎盘重量比也显著低于对照组。4.GYY4137缓解了CBS胎盘特异性敲低导致的IUGR。（1）与对照组相比,Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre♂×Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre♀交配组孕鼠血清中H₂S水平显著降低。（2）GYY4137显著增加了胎儿胎盘的重量,同时胎儿与胎盘重量比也显著增加。二、CBS敲低损伤了胎盘结构1.CBS敲低损伤了胎盘结构。（1）胎盘CBS敲低后,迷路区域的面积减小,迷路区域与连接区域的比减小。（2）PAS染色显示CBS敲低的胎盘蜕膜中成簇的糖原滋养层细胞明显增多,并且连接区域出现组织空泡。（3）HE染色显示,与对照组相比,Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre基因型胎盘合体滋养细胞围绕的母体血窦及血管内皮围绕胎儿血管面积显著减少;laminin免疫荧光结果显示Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre基因型胎盘迷路中胎儿血管密度减少,同时血管变窄。2.GYY4137缓解了CBS敲低导致的胎盘结构损伤。妊娠期小鼠在从GD8.5到GD17.5腹腔给药GYY4137（50mg/kg）,结果显示GYY4137处理后,胎盘中蜕膜糖原滋养层细胞数目减少,连接区域空泡减少,迷路面积增大。同时,GYY4137处理后迷路的母体血窦和胎儿血管面积增大,胎儿血管密度增加,分布更加有序。三、CBS敲低损伤了子宫胎盘的血流动力学1.CBS敲低损伤子宫胎盘的血流动力学多普勒超声结果显示与对照组相比,Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre♂×Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre♀交配组孕鼠子宫胎盘的螺旋动脉血流速度、中央血管血流速度以及脐动脉最大血流、最小血流和平均血流速度都显著降低,同时脐动脉的搏动指数增加。2.GYY4137缓解了CBS敲低导致的子宫胎盘灌注不足GYY4137增加了螺旋动脉、中央血管以及脐动脉血流速度,同时减少了搏动指数。四、CBS敲低损伤了子宫螺旋动脉重构利用免疫组织化学方法,我们分别标记了滋养层细胞的标志物cytokeratin及血管平滑肌的标志物α-SMA。与对照组相比,Cbs^f/f;Tpbpa/Ada-Cre基因型胎盘中,血管内衬中cytokeratin阳性的滋养层细胞减少,同时α-SMA阳性的平滑肌增多。GYY4137治疗组中,螺旋动脉内衬cytokeratin阳性的滋养层细胞增多,同时α-SMA阳性的平滑肌减少。五、CBS敲低引起线粒体损伤胎盘中CBS敲低导致了线粒体膜电位降低,线粒体超氧化物增多,线粒体ATP生成减少。GYY4137的治疗能够显著的减少CBS敲低导致的线粒体损伤。结论:根据以上研究,我们揭示了妊娠期胎盘中CBS敲低造成的血液循环中H₂S水平降低会引起线粒体功能异常,影响胎盘发育,导致胎盘血流灌注减少,造成胎儿宫内生长受限。