研究背景肾移植是治疗终末期肾脏疾病的重要方法。由于肾脏供体是受者同种异体抗原的持续来源,排斥反应是肾移植术后造成移植肾损伤的最直接和最重要的原因,是移植成败的最主要原因,因此,抗排斥治疗同肾脏供体一样将与受者相伴。为了预防和治疗排斥反应,环孢素(CsA), FK506、骁悉(MMF)等小分子药物以及抗CD3、抗CD25等抗体类免疫抑制剂相继问世,极大提高了移植成功率,大大促进了移植学的发展。然而,抗排斥药是把双刃剑,它可以保护肾脏免受免疫损伤,同样也可以导致严重感染而使患者死亡。因此,如何把握免疫抑制剂的用量,在排斥和感染之间找到平衡点是目前肾移植以及所有器官移植的重要难题。解决排斥和感染这对矛盾,寻找免疫平衡点,需要准确的免疫状态评估方法。肾移植受者长期服用免疫抑制剂,机体的免疫状态随免疫抑制剂剂量的调整而变化,在一定的抑制范围内,机体仍具有基本的免疫能力,但又不足以造成明显的免疫损伤,我们称之为合理的抑制范围。临床医师大多根据患者的血药浓度、临床症状和体征、尿量、血肌酐水平、影像学检查以及自身的临床经验判断患者抑制过度还是不足,并据此调整患者的抑制剂用量。然而,这种方法具有一定的主观性和滞后性,当出现临床症状和生化、影像学异常时排斥反应往往已经发生,肾脏已经受到严重的免疫损伤。因此,临床急需一种免疫评估方法,它能够在排斥反应发生之前提示免疫状态的强弱,预示排斥或感染的发生,使临床医师能够在排斥和感染发生之前及时调整免疫抑制剂的用量,避免排斥和感染的发生。虽然如何评价移植受者术后的免疫抑制状态至关重要,但国内外尚无可靠的方法。为此,需要一种准确和快速的检测方法,能够在较短的时间内判断患者的免疫状态,为临床的诊断和治疗提供必要的指导。我们认为,受者外周血中的免疫细胞在体外给予适当的刺激,通过分析细胞因子的分泌情况,可以准确评价患者免疫系统状况,为临床医师合理应用免疫抑制剂提供可靠依据。这是因为：(1)在外周血中细胞因子主要由免疫细胞分泌,它们是免疫细胞功能的重要参与者和表现者；(2)外周血受到免疫刺激后细胞因子会快速分泌；(3)在免疫抑制剂的作用下,患者免疫细胞的功能受到抑制,因此必然表现为在其受到刺激后细胞因子释放量和速度的改变；(4)据上所述,免疫抑制的程度与免疫细胞受刺激后所表现的因子谱的改变应当存在某种关联。将患者的临床征象与体外刺激免疫细胞后所获得的细胞因子谱进行对比分析,即可得出不同临床状态下的细胞因子谱。通过大规模统计分析,确定其诊断标准,最后为临床提供可靠的患者免疫状态评价体系,指导临床合理应用免疫抑制剂。液态悬浮芯片技术为快速测定多种细胞因子提供了技术保障。由于体内免疫细胞组成复杂以及功能状态的不断变化,测定单个细胞因子难以反映体内免疫细胞的整体功能,因而快速、微量、多种细胞因子同时测定的方法才能保证我们对任何一个患者都可以获得足够的细胞因子信息用以进行对比分析。由Luminex公司开发的液态悬浮芯片技术可以快速、微量、敏感地检测数十种细胞因子,是ELISA方法的替代产品。这一技术使得对检测样本进行大规模定量分析成为可能。该技术获得2005年临床诊断领域技术革新头奖。而且Bio-rad公司对该技术进行了进一步改进,如增加标准校正板,专用数据分析软件等,大大提高了检测范围、灵敏度(从0.2pg到3200pg)和可靠性。同时该技术还开发出一种随意组合技术(xplex)即检测者可以依据自己检测的需要对检测抗体进行组合,从而检测自己所需要的细胞因子。我们在前人研究探索的基础上提出了应用合适的免疫刺激剂活化外周全血免疫细胞,分析细胞因子的分泌情况,判断患者免疫状态,以下是我们对该方法探索过程的总结。一细胞因子谱评估免疫状态所需参数的摸索能够刺激外周全血分泌细胞因子的刺激剂较多,其中有丝分裂原(如PHA, ConA等)刺激能力较强,可以使免疫细胞较为充分的活化。我们比较了常见免疫刺激剂及其组合对外周全血刺激的效果,发现在相同的浓度下PHA刺激组大多数细胞因子浓度快速上升,并且高于其它免疫刺激剂或刺激剂组合组,因此,我们选择PHA作为本研究的刺激剂。不同的PHA浓度刺激效果存在差异,但随着PHA浓度的增大细胞因子浓度的增高潜力逐渐减小,因此,我们推测PHA刺激外周全血存在一个最佳浓度,即达到此浓度后继续增加PHA剂量,细胞因子的分泌不会相应增加,我们通过比较不同浓度PHA刺激外周全血的效果,发现10μg/ml的PHA刺激后细胞因子浓度上升最快,浓度最高,因此,我们将10μg/ml作为本研究PHA的刺激浓度。PHA刺激外周血后细胞因子的浓度会逐渐上升,由于细胞的增殖需要消耗部分细胞因子,因此,细胞因子的分泌和消耗,应该在刺激一定时间后达到动态平衡,我们比较了PHA刺激3h、6h、9h和12h的细胞因子分泌情况,尽管细胞因子浓度的变化各有特色,但大多数细胞因子在PHA刺激后6-12小时浓度达到峰值或平台值,此时,细胞因子的浓度相对稳定,因此,我们选择12小时为本研究的最佳刺激时间。此外,为了明确非稀释全血中的营养物质能否满足12小时培养的需要,我们还进行了外周血培养后PBMCs(外周血单个核细胞)活力的检测,将非稀释的外周全血培养13小时后分离PBMCs,进行流式检测,发现PBMCs的存活率在90%以上,并且,刺激组和非刺激组结果一致。通过逐步摸索,我们确定将PHA作为本研究的免疫刺激剂,10μg/ml作为本研究的PHA刺激浓度,12小时作为本研究的刺激时间。二免疫抑制剂对细胞因子谱的影响临床常用免疫抑制剂主有神经钙蛋白抑制剂(如环孢素A和FK506)、骁悉、糖皮质激素(如甲强龙和强的松)等。不同免疫抑制剂的作用机制各不相同,它们作用于外周全血后对细胞因子分泌的影响也必定有所不同,为了明确这些常用免疫抑制剂对细胞因子分泌的影响,我们选取了FK506、MPA(骁悉的有效成分)和地塞米松(按照强的松和甲强龙的作用效能比换算)作为免疫抑制剂的代表,并选取临床常用浓度进行体外实验。分别将上述免疫抑制剂和PHA同时加入外周全血,培养12小时,检测全血中细胞因子的分泌情况,发现三种免疫抑制剂均可影响细胞因子的分泌,但受影响的细胞因子谱不同,地塞米松抑制谱较宽，可以显著抑制大多数细胞因子的分泌,包括IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-17、IL-5、IL-10、IL-13、IL-1β和G-CSF(P值均小于0.05)。FK506抑制谱较窄,仅能抑制IL-2和IL-13的分泌(P值均小于0.05)。MPA抑制谱和FK506相同,仅能抑制IL-2和IL-13(P值均小于0.05),但MPA可以显著增加IL-1β的分泌(P<0.05),这是MPA所特有的,是骁悉作用的因子标识。由此可见,免疫抑制剂可以影响细胞因子的分泌,并且具有特征性因子谱。不同剂量的免疫抑制剂可以造成机体不同的免疫状态,据此,我们推测不同浓度的免疫抑制剂对细胞因子分泌的影响程度也应该不同,或者具有浓度依赖性,为了明确此推测,我们选择DEX(地塞米松)、FK506和MPA分析免疫抑制剂对细胞因子的作用是否具有浓度依赖性,我们将抑制剂浓度分为四个梯度作用于外周全血,与PHA同时加入外周全血,培养12小时,观察细胞因子的分泌情况,我们发现三种免疫抑制剂对细胞因子的作用均有浓度依赖性特点。因此,细胞因子检测可以反映免疫抑制剂造成的不同免疫状态。免疫抑制剂下调机体的免疫功能具有个体特异性,这种现象在临床较为常见,相同血药浓度的患者一些出现感染,而另外一些出现排斥反应,这是免疫抑制剂作用的个体差异所致。免疫抑制剂作用外周全血后对细胞因子分泌的影响是否也有个体差异性,以及在同一个体重复同样的操作所得结果是否可靠也不明确,为了了解个体间差异和和方法的可靠性,我们首先选择了地塞米松进行实验,发现DEX(地塞米松)对IL-5、IL-10和IL-13的抑制作用在3个健康志愿者之间存在差异(P值均小于0.05),在三名志愿者之间12种细胞因子的总体变异系数是23.95%±10.87%；在三次重复实验中DEX对细胞因子的抑制作用没有差异(P值均大于0.05),在三次重复实验中12种细胞因子的总体变异系数是16.05%±10.84%。由此可见,该检测方法是可靠的,不同个体的外周全血对同种免疫抑制剂的反应是存在差异的。由于机体免疫系统的复杂性,临床常采取多种免疫抑制剂联合应用的方案进行抗排斥治疗,因此,了解多种免疫抑制剂联合作用对外周血细胞因子分泌的影响显得很有必要。为了明确细胞因子的分泌能否反映多种免疫抑制剂的作用,我们选取了FK506+DEX、FK506+MPA以及FK506+DEX+MPA三种联合方案,分别将相应的免疫抑制剂和PHA同时加入外周全血,培养12小时,观察外周血细胞因子的分泌情况。我们发现多药联合后其作用可以保留单一药物的作用特点,并具有累加效应。含有DEX的组合可以抑制大多数细胞因子(P值均小于0.05),含有MPA的组合可以显著增加IL-1β的分泌(P<0.05),据此,细胞因子的分泌情况可以反映多药的联合作用。、三肾移植受者术后细胞因子谱的变化检测健康人细胞因子的体外实验表明该方法可以反映免疫抑制剂作用后的免疫细胞的功能状态,提示通过此方法可以评估器官移植患者术后机体的免疫状态。器官移植患者由于服用多种免疫抑制剂,并且体内长期带有同种异体抗原,因此,体内情况更为复杂,细胞因子能否反映临床患者的真实免疫状态尚难确定。为了明确此方法能否反映临床患者的免疫状态变化,我们精心挑选了两例典型的肾移植患者进行对比观察,对细胞因子谱评估免疫状态的方法进行初步检验。两例患者中一例是二次移植,PRA阳性,另一例是初次移植,PRA阴性,供肾来自同一供者。二次移植患者术后出现了排斥反应,再次出现肌酐升高和尿量减少；初次移植患者术后恢复良好,肾功能迅速恢复正常。二次移植患者在排斥反应指征出现之前细胞因子分泌明显高于初次移植患者,并且细胞因子的变化同临床指征变化具有一致性。我们检测了17种细胞因子,发现IL-2, IL-4, IL-6, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α的变化规律与排斥患者的临床状况的改变一致,并且比临床症状更敏感和有更好的时间优势；肾功能稳定患者的多数细胞因子浓度一直保持在较低水平,其血药浓度检测也显示浓度过高,两者具有一定的相关性。由此可见,细胞因子检测评估肾移植受者机体免疫状态是可行的。为了进一步评估和优化该方法,还需要收集更多患者的临床样本,动态观察细胞因子的分泌,通过多参数统计分析准确判断机体的免疫状态。本研究的主要创新点1.目前,在世界范围内尚无确切可靠的方法来判断患者的免疫状态,该项目的研究将填补此方面的空白,面向临床,服务患者。2.抓住器官移植受者免疫状态这一主要矛盾,瞄准免疫细胞活化这一关键环节,通过测定移植受者免疫细胞活化能力来判断免疫系统功能,进而为临床合理应用免疫抑制剂提供可靠数据。3.采用全血检测,最大程度地保持了体内复杂的环境,同时缩短检测时间,满足了临床快速检测的要求,适于推广应用。4.采用多细胞因子整体分析,综合评估,更能反映体内细胞因子相互作用网络的真实情况,更具有代表性。