论文部分内容阅读
本文通过生物信息学预测与实验工作相结合的方法，对棒杆菌中芳香族氨基酸相关转运蛋白进行研究。构建NCgl1108(PhePcg)表达、基因敲除和互补重组菌株，当以非标记和14C-标记的L-Phe为底物时，C.glutamicum RES167△ncgl1108相比出发菌株RES167生长和吸收出现明显的下降。在ncgl1108敲除菌株中表达PhePcg恢复了对L-Phe底物的利用能力和吸收能力。L-Phe的吸收不受9种代表性氨基酸抑制，但能被L-Tyr抑制。RES167△(ncgl1108-aroPcg)/pGXKZl转运L-Phe的Km和Vmax分别为10.4±1.5μM和1.2±0.1 nmol min-1(mg DW)-1。利用绿色荧光蛋白(GFP)和PhePcg构建融合蛋白，确PhePcg定位在细胞外周部位。在一定条件下，PhePcg对L-Tyr也有一定的转运作用。PhePcg是C.glutamicum中一个新的芳香族氨基酸转运蛋白。构建NCgl0464(GabPcg)基因敲除和互补重组菌株，当以非标记和14C-标记的γ-氨基丁酸为底物时，C.glutamicum RES167△ncgl0464失去了利用γ-氨基丁酸生长和吸收γ-氨基丁酸的能力，互补菌株恢复了生长和吸收能力。γ-氨基丁酸的吸收仅能被L-Asn(31.6％)和L-Gln(20.0％)抑制，不能被检验的其它18种常见氨基酸抑制。GabPcg的转运机制为底物与OH-同向转运型或底物与H+反向转运型。在pH7.5时，RES167△(ncgl1108-aroPcg)/pGXKZ7转运γ-氨基丁酸Km和Vmax值分别是34.2±1.1μM和67.3±1.0 nmol min-1(mg DW)-1。GabPcg与生物中已知的γ-氨基丁酸转运蛋白在氨基酸序列、转运机制、底物特异性等方面均有显著差异。GabPcg是一个新型的γ-氨基丁酸转运蛋白，是C.glutamicum中首次发现的γ-氨基丁酸转运蛋白。氨基酸外运实验表明，RES167△ncgl0464与出发菌株RES167相比细胞外L-Trp积累量明显增加，而RES167△ncgl0464/pGXKZ7的细胞外L-Trp积累量显著降低。以此为依据，对产L-Trp的C.pekinense PD-67进行改造，构建重组菌株C。pekinense PD-67△aroPcp、PD-67△0464cp和PD-67△aroPcp△0464cp。发酵结果表明，各菌株L-Trp细胞外积累量分别提高50％、10％和80％以上。