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目的观察1,25-二羟维生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3]对人胃癌细胞的影响,探讨1,25(OH)2D3是否抑制胃癌细胞的增殖并诱导其凋亡,并进一步探讨1,25(OH)2D3是否通过p53介导的线粒体途径诱导细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用。方法1.噻唑蓝还原法(MTT)检测不同时间干预下,不同浓度1,25(OH)2D3对MGC-803细胞增殖活性的影响。2. Annexin V-FITC/PI染色后,流式细胞术(FCM)检测不同浓度1,25(OH)2D3作用后,MGC-803细胞凋亡率的变化。3.荧光探针罗丹明-123检测不同浓度1,25(OH)2D3作用后,MGC-803细胞线粒体膜电位的变化。4.荧光探针DCFH-DA检测不同浓度1,25(OH)2D3作用后,MGC-803细胞内ROS生成的变化。5. RT-PCR法检测不同浓度1,25(OH)2D3干预后,MGC-803细胞内p53mRNA的变化。6.分光光度法检测不同浓度1,25(OH)2D3干预后,MGC-803细胞内Caspase-3、9活性的变化。结果1.MTT结果显示：10-8mol/L浓度组作用细胞24h、48h、72h、96h后,细胞存活率依次为(96.37±5.68)%、(89.29±2.72)%、(75.76±3.48)%、(76.03±1.22)%、10-7mol/L浓度组作用细胞24h、48h、72h、96h后,细胞存活率依次为(92.09±7.39)%、(85.26±4.69)%、(65.05±2.41)%、(63.68±1.25)%、10-6mol/L浓度组作用细胞24h、48h、72h、96h后,细胞存活率依次为(82.34±4.1)%、(73.86±6.48)%、(53.56±1.94)%、(49.58±1.24)%、10-5mol/L浓度组作用细胞24h、48h、72h、96h后,细胞存活率依次为(71.99±6.71)%、(59.43+3.57)%、(40.62±1.73)%、(37.06±1.84)%。正常对照组与溶媒组的细胞存活率在各时间段均无统计学意义P>0.05)；不同浓度1,25(OH)2D3作用于人胃癌细胞MGC-803相同时间后,除10-8mol/L浓度组作用24h后细胞存活率较溶媒组比较无显著性差异P>0.05),其余浓度组细胞存活率显著降低(P<0.05)；同一浓度1,25(OH)2D3作用MGC-803细胞不同时间后,细胞存活率较溶媒组比较显著降低(P<0.05)。MTT结果表明,1,25(OH)2D3可抑制肿瘤细胞活性,且呈剂量、时间依赖性。2.倒置显微镜下观察1,25(OH)2D3作用后,细胞形态发生改变,见细胞固缩变圆且数目明显减少,部分细胞失去贴壁能力,脱落于培养液中。FCM检测结果显示：1,25(OH)2D3对MGC-803细胞处理72h后,溶媒组,10-8mol/L、10-7mol/L、0-6mol/L> 10"5mol/L浓度组的早期凋亡率依次为(2.67±0.32)%、(4.20±0.41)%、(5.17±0.40)%、(11.50±-0.66)%、(19.63+0.75)%；中晚期凋亡率依次为(1.10±-0.20)%、(1.17±0.15)%、(1.67+0.38)%、(1.03±0.21)%、(3.30±0.56)%。随着1,25(OH)2D3浓度的增加,细胞早期凋亡率也随之升高,10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L浓度组较溶媒组相比,差异均有统计学意义衅0.01)；细胞中晚期凋亡率除了10-5mol/L浓度组,其余浓度组较溶媒组相比,差异均无统计学意义((P>0.05)。 FCM结果表明：1,25(OH)2D3可诱导人胃癌MGC-803细胞早期凋亡,且呈剂量依赖性。3.1,25(OH)2D3对MGC-803细胞处理72h后,FCM法检测线粒体膜电位结果显示：在给予10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、0-5mol/L浓度的1,25(OH)2D3处理MGC-803细胞72h后,Rho-123荧光强度分别为溶媒组的0.94(P<0.05)、0.91(P<0.05)、0.83(P<0.01)、0.71(P<0.01)。线粒体膜电位结果表明：1,25(OH)2D3可使线粒体膜电位下降,且呈剂量依赖性。4.1,25(OH)2D3对MGC-803细胞处理72h后,倒置荧光显微镜下观察在给予10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L浓度的1,25(OH)2D3处理MGC-803细胞72h后,发现细胞内荧光强度与浓度呈正相关；FCM法检测细胞内ROS生成量,10-8mol/L、10±7mol/L、 10-6mol/L、10-5mol/L浓度组分别为溶媒组的1.05倍(P>0.05)、1.2倍(P<0.05)、2.15倍(P<0.01)、2.9倍(P<0.01)。ROS检测结果表明：1,25(OH)2D3可促进细胞内ROS生成,且呈剂量依赖性。5.1,25(OH)2D3对MGC-803细胞处理72h后,细胞内p53mRNA转录水平的变化显示：在给予 10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L,10-5mol/L浓度的1,25(OH)2D3处理MGC-803细胞72h后,p53mRNA的表达量上调,分别为溶媒组的0.97(P>0.05)、1.25倍(P>0.05)、1.74倍(P<0.01)、2.68倍(P<0.01)。 RT-PCR检测结果表明：1,25(OH)2D3可诱导细胞内p53的转录表达,且呈剂量依赖性。6.1,25(OH)2D3对MGC-803细胞处理72h后,Caspase-3检测结果显示：溶媒组和10-8mol/L,10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L浓度组的pNA浓度分别为(19.08±2.1)、(18.28±1.33、(28.62±2.16)、(31.96±2.17)、(40.23±3.06)μmol/L; Caspase-9检测结果显示：溶媒组和10-8mol/L,10-7mol/L, 10-6mol/L, 10-5mol/L浓度组的pNA浓度分别为(22.88±2,53)、(25.75±3.53)、(32.53±1.33)、(49.08±2.27)、(79.65±4.23)μmol/L。 10-8mol/L浓度组Caspase-3、9活性与溶媒组比较,差异无统计学意义(P>0.05); 10-7mol/L,10-6mol/L, 10-5mol/L浓度组较溶媒组相比,均有显著性差异(P<0.01)。实验结果表明：1,25(OH)2D3能诱导Caspase-3、9的活化,且呈剂量依赖性。结论1,25(OH)2D3可诱导人胃癌细胞MGC-803的凋亡,其作用机制可能与p53介导的线粒体途径依赖的细胞凋亡机制有关。