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DYSFUNCTIONAL TAPETUM1(DYT1)是一个在拟南芥花药发育以及绒毡层早期分化与行使功能过程中必不可少的中心调控因子。本研究分析了DYT1启动子的顺式元件,并对其核心区域启动子的时空表达做了进一步研究,我们将可互补的启动子片段的5’端逐级缺失成六段(按转录起始方向,-631、-550、-463、-331、-180、-94),分别构建入含报告基因GUS的pBI121载体中,并取代pPBI121中的CaMV35S启动子,转化拟南芥野生型植株,获取转基因株系。组织化学染色分析六株转基因植株花序花药,-631、-550启动子片段花药染色呈阳性,而-463启动子片段以及进一步缺失的片段因缺失了具ACGT和GTGA等顺式元件的核心启动子区域,故而无法检测到GUS的活性。取-550启动子片段的花药为材料,制备GUS探针,原位杂交实验表明该长度启动子片段驱动GUS在花药发育的第三期开始在绒毡层表达,到第五期的表达量达到最高,并在随后的时期内表达量逐渐降低,与先前报道的DYT1在野生型Ler中的表达谱相一致,表明该段启动子包含了DYT1正常表达的遗传信息,并存在潜在的上游调控基因的结合位点。
为进一步探究转录因子DYT1结合的下游靶基因,本研究小组根据NCBI数据库的序列设计DYT1特异性引物,经PCR扩增其624 bp cDNA片段后,将扩增出的片段连入pMD18-T载体中,EcoRI和XhoI双酶切后克隆到具相同酶切位点的原核表达载体pET-32a(+)中,以构建DFT1原核表达载体,IPTG诱导表达重组蛋白并将可溶性重组蛋白作为抗原免疫新西兰兔以制备多克隆抗血清。Western Blot法检测多克隆抗体的特异性,ELISA测定多克隆抗血清的效价。结果表明:构建的原核表达载体转化入表达菌株BL21菌株后,经IPTG诱导,成功地表达了分子量约为50KDa的重组蛋白。Western Blot证实其具良好的免疫原性,ELISA结果表明融合蛋白的效价>1:5120。这些工作为进一步用分子生物学手段研究该转录因子的DNA结合位点和转录调控网络作了铺垫。