论文部分内容阅读
黏附侵袭性大肠杆菌(adherent-invasive Escherichia coli,AIEC)与肠道感染的发生发展密切相关,其毒力因子影响自身在肠上皮和巨噬细胞内的存活与复制,近年来受到广泛关注的炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)可能与该致病菌密切相关。AIEC引发IBD的致病机理目前尚不明确,其鞭毛和菌毛被认为是主要的两大致病因子。AIEC菌株中基因fliC编码的鞭毛蛋白是鞭毛丝的主要结构亚基,参与细菌的一系列致病过程。Ⅰ型菌毛中fimH亚单位作为Ⅰ型菌毛的主要组成部分,在介导细菌黏附宿主细胞的同时,为进一步侵入机体创造条件。本研究以鞭毛蛋白FliC和Ⅰ型菌毛主要结构亚单位FimH为切入点,探究其在AIEC中所发挥的生物学作用,从而更好地理解AIEC的致病机理。首先通过比对NCBIGenBank上不同大肠杆菌E.coli菌株的E.ciku菌株的H基因序列,设计相应的PCR引物用于扩增检测AIEC菌株LF82(Wild-type,083:H1)中的fliC、fimH基因,对扩增后基因产物进行纯化、克隆以及序列测定。依据LF82的fliC、fimH基因序列设计相应的缺失引物用于Red同源重组的一步PCR法缺失靶基因。这两对缺失引物5’端分别与fliC、fimH两翼序列同源,而3’端与质粒pKD3上氯霉素抗性基因cat两翼序列同源。运用λ-Red同源重组系统,以质粒pKD3为模板,通过缺失引物扩增出含cat抗性片段的PCR产物纯化后,将该融合片段导入含有质粒pKD46的LF82菌株内,在三种Red同源重组酶的作用下,cat基因片段与靶基因发生同源重组,将fliC、fimH基因置换下来,在氨苄、氯霉素抗性平板上筛选出一次同源重组菌LF82△fliC::cat、LF82△fimH::cat和LF82△fliC△fimH::cat。随后,将质粒pCP20电转导入一次重组菌内,利用其编码表达的F1p重组酶识别cat阅读框两侧F1p位点,消除氯霉素抗性基因。最后,依据PCR检测结果及测序结果分析,确认成功构建出fliC、fimH基因缺失株LF82△fliC、LF82△fimH及双缺失株LF82△fliC△fimH。并在此基础上,分别将表达fliC基因、fimH基因的pBR322质粒电化学转化入LF82△fliC、LF82△fimH中,成功构建缺失株LF82△fliC、LF82△fimH的回补株LF82△fliC/pfliC、LF82△fimH/pfimH，细菌生长曲线实验结果显示各菌株生长曲线无明显差异。细菌半固体培养基运动实验结果显示缺失了fliC基因的菌株在半固体培养基上无运动性,而野生株、fimH缺失株与回补株均可观察到明显的运动环。生物被膜定量试验表明FliC与FimH均能显著影响LF82生物被膜的形成(p<0.05),其中fimH缺失株生物被膜形成能力下降更为明显(p<0.01)。体外对Caco-2细胞的黏附试验结果显示fliC缺失株、fimH缺失株及双缺失株的黏附能力分别明显下降约74%、72%、85%(p<0.01);体外对Caco-2细胞的侵袭试验中,fliC缺失株、fimH缺失株及双缺失株的侵袭能力分别下降约59%(p<0.05)、58%(p<0.05)、86%(p<0.01)。随后通过Real-timePCR检测fliC缺失株、fimH缺失株及双缺失株主要毒力因子转录量的变化,结果显示,相对野生株LF82,fliC缺失株中Ⅰ型菌毛主要结构亚单位(fimH)、P菌毛(papC)、长极性菌毛(lpf)、细胞侵袭因子(ibeA)、溶血素(hlyA)的基因转录量分别下降了 43%,46%,74%,57%,94%,差异显著(p<0.05);fimH缺失株中fliC、papC、lpf、ibeA、hlyA基因转录量分别下降了 43%、52%、78%、62%、63%,差异显著(p<0.05)。双缺失株中fliC、fimH基因基本不转录,papC、hlyA基因转录量分别下降了 28%(p>0.05)、57%(p<0.05),而lpf、ibeA、vat基因转录量分别上调了 6%,29%,10%,差异均不显著。以上结果提示fliC和fimH基因参与LF82的生物学功能,且不同毒力因子之间发挥协同作用,共同参与致病机制。此外,黏附抑制试验结果显示LF82对Caco-2细胞的黏附作用可以被FliC多克隆抗体及D-甘露糖抑制,这提示FliC与FimH可能是其潜在的治疗靶点。小鼠肠道定植试验结果显示LF82主要定植于小鼠的盲肠和回肠部。在小鼠回肠部中,fliC、fimH单缺失株和双缺失株的定植能力较野生株相比,虽然分别下降约33%、25%、26%,但差异不显著,其潜在机制有待进一步探析。