背景肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。在美国肺癌是癌症死亡的首要原因。肺癌在我国发病率及死亡率均居恶性肿瘤首位,全球癌症数据调查显示中国肺癌患者在全球肺癌患者中占比最高,且近年来发病率仍然呈不断上升趋势。肺癌按病理类型分为腺癌（主要包括乳头状腺癌,支气管肺泡癌和混合型腺癌）,鳞癌,小细胞肺癌,大细胞肺癌,肉瘤样癌,类癌,癌肉瘤,腺鳞癌等。而临床主要将肺癌分为小细胞肺癌（Small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）两大类,其中小细胞肺癌占肺癌的20%-50%,分化程度极差,转移早,手术切除率低,放化疗敏感性较高。非小细胞肺癌是肺癌中最常见类型,占肺癌80%左右,与小细胞肺癌相比,非小细胞肺癌生长较慢,转移相对较晚,分化程度由低到高均有,其中鳞癌最常见（占30%-40%）,其次为腺癌（占20%-40%）,其余为支气管肺泡癌、大细胞癌和混合癌。非小细胞肺癌手术切除率较高,对放化疗敏感性较低,此类病症致病机制还未完全阐明,增加临床治疗难度,加之肿瘤生物学行为多样性,虽然疾病临床诊治手段不断更新,但患者生存率仍然很低。目前,手术与化疗仍为肺癌治疗主要方法,但多数患者确诊后已经是中晚期,错失手术最佳治疗时机,患者一线化疗的中位生存期较短,约为9-10个月,因此积极寻找肺癌有效治疗方法对患者生存率提高有着十分重要作用。随着医疗技术不断发展以及对肺癌发生机制地深入研究,近年来靶向治疗成为肺癌治疗新的趋势,而且临床应用疗效显著。鉴于晚期非小细胞肺癌预后差,临床早期采取可靠诊断方法对疾病尽早治疗具有重要意义。人类Wnt（Wingless-Intl,Wnt）基因家族由19个成员组成,编码具有22或24个半胱氨酸残基的保守糖蛋白,Wnt基因最早是在1982年作为小鼠乳腺肿瘤病毒优先整合位点而被发现,该基因能够在细胞间传递增殖和分化信息,为癌基因,其与果蝇的无翅基因属同源基因,因此将其命名为Wnt基因。随着研究的深入,发现Wnt家族高度保守,从低等动物到人类其同源性达到83%,其编码的蛋白,能够启动细胞内信号途径,传导生长刺激信号,参与发育,细胞分化与增值。Wnt信号传导包括三个重要的环节,首先是Wnt配体与细胞膜受体的特异结合,其次引发细胞内的级联反应,从而调节核内的基因表达。有研究发现,Wnt与其他的细胞功能和信号传递相互交错,形成网络调节模式,其主要框架有:1.Wnt/β-连环蛋白途径（canonical Wnt/β-cantenin pathway,Wnt/β-cantenin）,该途径为典型的Wnt/β-cantenin信号途径,主要通过β-cantenin的核易位,激活靶基因的转录活性。2.Wnt/平面细胞极性途径（Planar cell polarity pathway,PCP）:主要作用是在胚胎发育阶段调控细胞骨架的重排,并参与原肠胚形成,迄今未发现涉及肿瘤事件的报道。3.Wnt/Ca2+途径,由Wnt5a和Wnt11激活,通过增加细胞内钙的含量,激活蛋白激酶C（Proteinkinase C,PKC）,磷脂酶 C（Phospholipase C,PLC）和转录因子 NF-AT,Wnt/Ca2+途径和Wnt/β-cantenin信号途径相互作用,与肿瘤的发生有一定的联系,但具体的过程和机制尚不清楚。Wnt信号传递是由多因子组成,涉及多个环节和调控的复杂过程。正常的细胞生长发育具有一定的规律,通常Wnt信号通路关闭,当被激活后,细胞分化、凋亡、增殖出现多个变化,这也是肿瘤形成的原因之一。Wnt信号进入到细胞内,将信号传递到Dishevelled蛋白（Dvl/Dsh）,后者激活后抑制轴蛋白（Axin）、腺瘤性结肠息肉病基因蛋白（adenomatouspolyposiscoli,APC）和糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）复合物,复合物不能磷酸化β-cantenin。由于非磷酸化的β-cantenin不能被细胞内的蛋白酶降解,导致β-cantenin在细胞内堆积,并转向细胞核,进入细胞核后与T细胞因子/淋巴细胞增强因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF）结合,激活TCF转录,调节靶基因的表达,因此β-cantenin是否磷酸化是Wnt信号通路是否能发挥作用的关键。β-cantenin-TCF/LEF复合体是Wnt信号中的关键环节,β-cantenin转移到细胞核内,并与TCF/LEF结合就可以激活Wnt信号,最终导致β-cantenin-TCF/LEF大量堆积。异常堆积的β-cantenin激活TCF/LEF导致下游靶基因转录,推动细胞周期发展产生异常蛋白,最终导致细胞癌变。有大量研究发现,多种肿瘤存在β-cantenin基因突变,其中甲状腺癌、结肠癌、卵巢癌其突变率可高达50%以上,β-cantenin活性状态还受Wnt上游分子的影响,主要有APC,GSK-3β和Axin。同样,Wnt3在非小细胞肺癌中表达上调,同时也与非小细胞肺癌患者的生存率密切相关,但是,Wnt3致瘤机制尚不清楚。目的通过研究Wnt3在非小细胞肺癌组织中的表达,明确Wnt3与非小细胞肺癌的关系,通过RNAi技术抑制Wnt3在非小细胞肺癌中的表达,从而进一步的研究Wnt3在非小细胞肺癌细胞分化、细胞周期和凋亡中的作用。本文的研究结果为寻找非小细胞肺癌新的药物靶点提供基础实验研究结果,其实验成果可以直接应用到新型抗非小细胞肺癌的药物研发和临床治疗,对于提高非小细胞肺癌化疗药物的疗效,降低患者和家庭的痛苦,降低社会经济负担具有重要的意义。方法第一部分1.1非小细胞肺癌病理组织及癌旁组织的收集与固定全部实验肺癌组织均经南方医科大学伦理委员会及解放军东部战区总医院（原南京军区总医院）伦理委员会审核。全部受试者均签署患者知情同意书,从2014年2月-2015年6月共收集30例非小细胞肺癌的病理组织及其配对的癌旁组织（癌旁组织是在肿瘤组织边缘外1cm取材）,病理组织取材选取未经化疗、放疗和其他药物治疗的患者肺癌组织和癌旁组织。取材后全部标本迅速用1%的甲醛溶液或液氮快速冷冻,并储存在-80℃冰箱中。全部实验肺癌组织进行临床病理分型。1.2病理组织中Wnt3免疫组织化学染色非小细胞肺癌组织用4%的甲醛固定,固定后石蜡固定薄层切片,用Wnt3免疫组织化学染色试剂进行染色,免疫组织化学实验基本流程:组织细胞标本进行抗原修复,阻断内源性过氧化物酶,再用血清封闭,继而滴加特异性一抗,再滴加二抗,滴加三抗和显色剂,最后复染后封片。切片浸泡到柠檬酸盐缓冲液15分钟,使抗原充分结合,抗体采用鼠抗人Wnt3抗体,37℃孵育1小时,然后用辣根过氧化物酶-抗鼠抗体进行室温孵育30分钟,然后用苏木精染色Wnt3抗原抗体结合物。1.3蛋白分离与免疫印迹反应从非小细胞肺癌组织细胞中利用胞溶缓冲液及蛋白酶抑制剂,提取的蛋白首先用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离,转膜到硝酸纤维素膜,然后用2%的牛血清蛋白封膜4℃过夜,用鼠抗人Wnt3抗体孵育（磷酸甘油醛抗体作为对照组）,37℃孵育1小时,继而室温下用辣根过氧化物酶复合抗鼠抗体孵育40分钟,在每次孵育后均用洗涤液清洗,最后,利用电化学发光系统检测条带。第二部分2.1细胞培养与分化人类非小细胞肺癌A549细胞在DMEM培养基中培养。用10%小牛血清在37℃潮湿5%CO2培养箱中培养。细胞浓度为85%时分离到新的培养瓶中培养,用顺铂干扰细胞,采用2uM顺铂直接加入到培养基。2.2实时荧光定量PCR分析Wnt3 mRNA水平利用TRIzol试剂及RNase抑制剂从A549细胞中提取mRNA,通过RT-PCR进行扩增,荧光定量PCR分析Wnt3 mRNA,检测Wnt3 mRNA水平与内部质控3-磷酸甘油醛,计算ΔΔCt相对量。2.3蛋白分离与免疫印迹反应利用胞溶缓冲液及蛋白酶抑制剂从A549细胞中提取蛋白,首先用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离,然后转膜到硝酸纤维素膜,再用2%的牛血清蛋白封膜4℃过夜,然后用鼠抗人Wnt3抗体孵育（磷酸甘油醛抗体作为对照组）,37℃孵育1小时,继而室温下用辣根过氧化物酶复合抗鼠抗体孵育40分钟,每次孵育后均用洗涤液清洗,最后,利用电化学发光系统检测条带。第三部分3.1细胞培养与分化人类非小细胞肺癌A549细胞在DMEM培养基中培养,用10%小牛血清在37℃潮湿5%CO2培养箱中培养。细胞浓度为85%时分离到新的培养瓶中培养,用顺铂干扰细胞,采用2uM顺铂直接加入到培养基。3.2细胞增殖及克隆形成实验CCK法检测细胞增殖:A549细胞增殖利用CCK-8检测,将细胞用Wnt3-specific siRNA（siRNA 1/2-Wnt3）和对照 control siRNA（siRNA-Ctrl）转染0,24,48和72小时,加入CCK-8试剂10μL,于37℃、5%CO2培养2小时,利用分光光度仪检测在450 nm的吸光度（A）。计算细胞增殖率。细胞增殖率=（转染祖细胞A/对照组细胞A）×100%。平板克隆形成实验:将A549细胞种植于12孔细胞板上,然后转染50 nM siRNA 1/2-Wnt3和siRNA-Ctrl,细胞继续孵育72小时,细胞克隆被0.007%结晶紫染色10分钟,然后用UVP生物分光镜500成像系统检测其克隆形成率。3.2流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡细胞周期实验主要步骤:A549细胞用0.25%EDTA胰蛋白酶消化,700 μL缓冲剂及7-氨基-放线菌素在37℃孵育10分钟,再加入300 μL缓冲液配有2ul膜联蛋白-V-藻红蛋白,A549染色细胞用70%酒精4℃固定2小时,用0.5 mg/mL RNase A37℃孵育10分钟,然后加入5μL碘化丙啶,室温下孵育30分钟,参照实用说明书用流式细胞仪检测细胞周期。细胞凋亡分析步骤:A549细胞加入500 μL缓冲液并加入1μL 7AAD室温孵育15分钟,另外加入450 μL缓冲剂及7-氨基-放线菌素在37℃孵育15分钟,利用流式细胞仪检测细胞凋亡,数据采用FlowJo软件分析。3.3蛋白分离与免疫印迹反应从A549细胞中利用胞溶缓冲液及蛋白酶抑制剂提取的蛋白,首先用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离,转膜到硝酸纤维素膜,然后用2%的牛血清蛋白封膜4℃过夜,之后用鼠抗人caspase 9和caspase 3抗体孵育（磷酸甘油醛抗体作为对照组）,37℃孵育1小时,继而室温下用辣根过氧化物酶复合抗鼠抗体孵育40分钟,在每次孵育后均用洗涤液清洗,最后,利用电化学发光系统检测条带。3.4裸鼠种植肿瘤实验在超净工作台上无菌操作,利用过氧乙酸或新洁儿灭进行消毒,穿好防护服。按照手术室操作规程进行无菌消毒,取对数生长的非小细胞肺癌细胞（正常 A549 细胞组 8 只,转染 Wnt3-specific siRNA（siRNA 1/2-Wnt3）A549 细胞组16只）注射到裸鼠右侧后肢,注射剂量为0.4ml,其中含有1x108个细胞,当种植肿瘤大小达到15-20mm时,将造模成功小鼠随机分为3组（正常A549细胞组;转染组;转染+顺铂化疗组）,每组8只,其中一组转染组顺铂剂量为1.Omg/kg,每天皮下给药一次,正常A549细胞组和另外转染组分别注射同体积生理盐水,第9天同时处死,分离肿瘤组织,比较不同组别间肿瘤体积的大小。结果第一部分1.1免疫组织化学非小细胞肺癌组织免疫组化结果显示,Wnt3呈阳性表达,与癌旁组织相比较,Wnt3在非小细胞肺癌组织中过表达,经比较,差异具有统计学意义（p=0.0037）。1.2Wnt3 mRNA及蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达为了研究Wnt3信号通路在非小细胞肺癌微环境中的作用,我们检测了非小细胞肺癌组织中Wnt3的mRNA水平及蛋白表达。RT-PCR检测结果显示,Wnt3在非小细胞肺癌组织中mRNA水平均高于癌旁组织,经比较,差异具有统计学意义（p=0.0018）;Western blotting检测结果显示,Wnt3蛋白表达水平均高于癌旁组织,经比较,差异具有统计学意义（p=0.0044）。第二部分2.1 Wnt3蛋白在非小细胞肺癌A549细胞中的表达为了研究Wnt3信号通路在非小细胞肺癌A549细胞中的作用,我们检测了A549细胞中Wnt3蛋白表达。Western blotting检测结果显示,Wnt3蛋白表达水平均高于对照组,经比较,差异具有统计学意义（p=0.014）。2.2 Wnt3 mRNA在非小细胞肺癌A549细胞中的表达为了研究Wnt3信号通路在非小细胞肺癌A549细胞中的作用,我们进一步检测了 A549细胞中Wnt3 mRNA的水平。RT-PCR检测结果显示,Wnt3在非小细胞肺癌A549细胞中mRNA的水平均高于对照组,经比较,差异具有统计学意义（p=0.0018）。第三部分3.1 Wnt3-siRNA转染非小细胞肺癌A549细胞抑制细胞分化为了研究Wnt3在非小细胞肺癌肿瘤发生中的作用,我们合成了特异性的Wnt3-siRNA质粒,转染到非小细胞肺癌A549细胞中。转染30 nM和60 nM Wnt3-特异siRNA到非小细胞肺癌A549细胞中,与对照组siRNA-Ctrl比较,转染组细胞Wnt3显著性降低,其中60 nM Wnt3-特异siRNA转染细胞Wnt3最低（p＜0.05 or p＜0.01）。同时测量 siRNA 1/2-Wnt3 和 siRNA-Ctrl 转染 A549 细胞后的生长曲线,siRNA 1-Wnt3和siRNA2-Wnt3转染A549细胞后,其生长率较siRNA-Ctrl转染A549细胞低,经比较,差异具有统计学意义（p＜0.01 or p＜0.001）。为了进一步验证抑制Wnt3对A549细胞分化的影响,对三个转染组即siRNA 1-Wnt3 和 siRNA 2-Wnt3 和 siRNA-Ctrl 转染 A549 细胞组进行比较,siRNA 1-Wnt3转染组（p＜0.01）和siRNA2-Wnt3（p＜0.05）转染组细胞克隆率显著降低,经比较差异具有统计学意义。3.2Wnt3-siRNA转染非小细胞肺癌A549细胞对细胞周期的影响为了进一步验证抑制Wnt3后对细胞周期的影响,利用流式细胞仪检测细胞周期,与siRNA-Ctrl转染A549细胞组相比较,siRNA 1-Wnt3组和siRNA 2-Wnt3组细胞S期细胞所占比例较少,三组间比较,差异具有统计学意义。两组G0/G1所占细胞比例上调,但差异无统计学意义。3.3Wnt3-siRNA转染非小细胞肺癌A549细胞对细胞凋亡的影响为了进一步验证抑制Wnt3后对细胞凋亡的影响,用2 μM铂顺干扰下,与空白对照组比较,siRNA 1-Wnt3组和siRNA 2-Wnt3组诱导的细胞凋亡率更高。继续检测细胞凋亡相关蛋白表达的变化,Western blotting检测结果显示,与空白对照组比较,siRNA 1-Wnt3 组和 siRNA2-Wnt3 组细胞 caspase 9 和 caspase 3表达增多,差异具有统计学意义（p＜0.01）。3.4Wnt3-特异siRNAs（siRNA 1/2-Wnt3）转染细胞组与转染后顺铂治疗组小鼠肿瘤体积的变化经比较,三组均随着小鼠存活时间的延长,肿瘤体积逐渐的增大,进一步比较,同期肿瘤体积转染细胞+顺铂药物组＜转染细胞组＜正常A549细胞组。结论1.与癌旁组织相比较,非小细胞肺癌组织免疫组化Wnt3呈阳性表达。2.Wnt3在非小细胞肺癌组织中mRNA水平及蛋白表达均高于癌旁组织。3.Wnt3 mRNA和蛋白在非小细胞肺癌A549细胞中高表达。4.转染Wnt3-特异siRNA到非小细胞肺癌A549细胞中,细胞Wnt3表达显著性降低,其中转染计量越大,Wnt3表达越低,呈计量依赖性。5.siRNA 1-Wnt3和siRNA 2-Wnt3转染非小细胞肺癌A549细胞后,其生长率较siRNA-Ctrl转染A549细胞低。转染量计越大,转染组细胞克隆率越低。6.siRNA 1-Wnt3组和siRNA 2-Wnt3组细胞S期细胞所占比例较少,两组G0/G1所占细胞比例上调,抑制细胞成熟。7.siRNA 1-Wnt3组和siRNA 2-Wnt3组诱导的细胞凋亡率更高,凋亡蛋白caspase 9和caspase 3表达增多,抑制Wnt3表达的非小细胞肺癌抑制了细胞分化,促进细胞凋亡。8.Wnt3-特异siRNAs（siRNA 1/2-Wnt3）转染细胞组与转染后顺铂治疗组小鼠肿瘤体积变化:转染细胞+顺铂药物组＜转染细胞组＜正常A549细胞组。因此本文通过研究Wnt3在非小细胞肺癌组织中的表达情况,探索Wnt3的表达与非小细胞肺癌临床病理特征的相关性,为寻找非小细胞肺癌治疗新的药物靶点提供有效的基础实验研究,同时我们发现Wnt3蛋白和mRNA在非小细胞肺癌组织和细胞中阳性表达,抑制Wnt3表达的非小细胞肺癌细胞,会随着转染浓度增大,抑制肺癌细胞的分化、增殖和克隆。本研究成果可以直接应用非小细胞肺癌药物的开发和临床治疗,无论是对于提高非小细胞肺癌的的治疗效果,降低患者的痛苦和家庭社会的经济负担均具有重要的意义和作用。